Die NAC-Transkriptionsfaktoren ATAF1 und ANAC055 beeinflussen die Hitzestressreaktion bei Arabidopsis

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 11264 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die vorherige Exposition (Priming) von Pflanzen gegenüber milden, nicht tödlichen erhöhten Temperaturen verbessert ihre Toleranz gegenüber einem späteren Stress durch höhere Temperaturen (auslösender Reiz), was von großer ökologischer Bedeutung ist. „Thermomemory“ hält diese Toleranz über einen längeren Zeitraum aufrecht. NAM/ATAF1/2/CUC2 (NAC)-Proteine sind pflanzenspezifische Transkriptionsfaktoren (TFs), die Reaktionen auf abiotischen Stress, einschließlich Hitzestress (HS), modulieren. Hier untersuchten wir die mögliche Rolle von NACs für das Thermogedächtnis. Wir haben die Expression von 104 Arabidopsis-NAC-Genen nach dem Priming und Auslösen von Wärmestimuli bestimmt und festgestellt, dass die ATAF1-Expression direkt nach dem Priming stark induziert wird und danach während der Thermoerholung unter die Kontrollwerte abfällt. Knockout-Mutanten von ATAF1 zeigen ein besseres Thermogedächtnis als der Wildtyp, was auf eine negative regulatorische Rolle schließen lässt. Differenzielle Expressionsanalysen von RNA-seq-Daten von ATAF1-Überexpressor-, ataf1-Mutanten- und Wildtyp-Pflanzen nach Hitzeprimierung ergaben fünf Gene, die primingassoziierte direkte Ziele von ATAF1 sein könnten: AT2G31260 (ATG9), AT2G41640 (GT61), AT3G44990 (XTH31). , AT4G27720 und AT3G23540. Basierend auf Koexpressionsanalysen, die auf die oben genannten RNA-seq-Profile angewendet wurden, identifizierten wir, dass ANAC055 transkriptionell mit ATAF1 koreguliert wird. Anac055-Mutanten zeigen wie ataf1 ein verbessertes Thermogedächtnis, was auf eine mögliche Co-Kontrolle beider NAC-TFs über das Thermogedächtnis schließen lässt. Unsere Daten zeigen eine zentrale Bedeutung von zwei NAC-Transkriptionsfaktoren, ATAF1 und ANAC055, für das Thermogedächtnis.

Temperaturen, die über den Anpassungsschwellen der Pflanzen liegen, verursachen Hitzestress (HS), der ihr Wachstum, ihr Überleben und ihre Produktivität verringert. Pflanzen sind von Natur aus in der Lage, eine gewisse Temperatur über ihrer Umgebungstemperatur zu vertragen. Dies wird als „basale Thermotoleranz“ bezeichnet. Zusätzlich zur basalen Thermotoleranz haben Pflanzen auch die Fähigkeit, Thermotoleranz zu erlangen, wenn sie zuvor milden, nicht tödlichen höheren Temperaturen ausgesetzt werden, in einem Prozess, der „Heat Priming“1,2,3,4 genannt wird. Dieses Hitze-Priming löst nicht nur eine sofortige Reaktion aus, sondern führt auch zu molekularen und metabolischen Veränderungen, die auch ohne Stress einige Zeit anhalten und es den Pflanzen ermöglichen, effektiver auf ein zweites HS-Ereignis zu reagieren. Der zweite Stress wird als „auslösender Reiz“3,4 bezeichnet. Der Zeitraum zwischen dem Auslösen und Auslösen von Reizen wird als „Gedächtnisphase“ bezeichnet, in der sich das Stressgedächtnis bilden und festigen kann. Thermogedächtnis bezieht sich auf die Aufrechterhaltung einiger, aber nicht aller HS-induzierten Veränderungen, die Pflanzen „vorbereiten“ oder darauf vorbereiten, schneller und stärker zu reagieren, wenn dieser Stress erneut auftritt, bevor das Gedächtnis nachlässt. Experimentelle Beweise deuten darauf hin, dass das Thermogedächtnis von mehreren Stunden bis zu Tagen4,5,6 oder sogar Generationen7 reichen kann. Das Thermogedächtnis scheint zumindest teilweise durch eine Reihe von Genen reguliert zu werden, die sich von denen unterscheiden, die bei der basalen Thermotoleranz und der erworbenen Thermotoleranz wirken1,4,5,8,9,10,11.

HS-Priming beinhaltet die Aktivierung von Hitzeschock-Transkriptionsfaktoren (HSFs), die die Expression von Hitzeschock-Proteinen (HSPs) induzieren, die dabei helfen, zelluläre Proteine vor Denaturierung zu schützen und zur Reparatur oder Entfernung fehlgefalteter Proteine beitragen12,13. Es wurde gezeigt, dass mehrere HSFs an der HS-Reaktion beteiligt sind9,14,15,16. Insbesondere gelten HSFA1 der Klasse als „Hauptregulatoren“ der HS-Reaktion16, die die Expression mehrerer anderer Transkriptionsfaktor-Gene (TF) regulieren, darunter DEHYDRATION RESPONSIVE ELEMENT BINDING PROTEIN 2A (DREB2A), HSFA2, HSFA7a, HSFBs und MULTIPROTEIN BRIDGING FAKTOR 1C (MBF1C)17. Während die unmittelbaren Reaktionen auf HS relativ gut untersucht sind, sind die molekularen und physiologischen Prozesse, die dem Thermogedächtnis in Pflanzen zugrunde liegen, noch nicht gut verstanden. Einer der möglichen Mechanismen beinhaltet die Akkumulation von TFs in ihrem inaktiven Zustand nach einem vorbereitenden Reiz (während der Gedächtnisphase) und ihre Aktivierung beim Erleben des auslösenden Reizes18,19. Beispielsweise wurde der Hitzeschockfaktor A2 (HSFA2) als Schlüsselkomponente bei der Etablierung des Thermogedächtnisses in vorbereiteten Pflanzen identifiziert9. HSFA2 induziert die Expression von HEAT STRESS-ASSOCIATED 32 (HSA32), das speziell für die Aufrechterhaltung des Thermogedächtnisses erforderlich ist und an der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase bei Hochtemperaturstress beteiligt ist8.

NAM/ATAF1/2/CUC2 (NAC) ist eine Familie pflanzenspezifischer TFs, die eine wichtige Rolle bei der Reaktion auf verschiedene biotische und abiotische Belastungen spielen, einschließlich Wassermangel, Salzgehaltstress und Temperaturstress20,21,22. Es wurde berichtet, dass mehrere NACs an der basalen HS-Reaktion in Arabidopsis thaliana und Nutzpflanzen beteiligt sind23,24,25,26,27. Beispielsweise verbesserte die Überexpression von ANAC019 die Thermotoleranz von Arabidopsis, vermutlich durch Regulierung der Expression von HSFA1s und anderen HSFs, einschließlich HSFBs25. Es wurde auch festgestellt, dass das Arabidopsis-Membran-assoziierte NAC-Transkriptionsfaktor-Gen NTL4 auf Hitzestress reagiert, und ntl4-Mutanten zeigten unter HS27 eine höhere Lebensfähigkeit der Zellen und eine geringere H2O2-Anreicherung als WT. In Reis (Oryza sativa) wird die Expression von SNAC3 durch verschiedene Stressfaktoren, einschließlich Hitze, induziert, und seine Überexpression erhöht die Toleranz gegenüber hohen Temperaturen, Trockenheit und oxidativem Stress26. Die Expression des NAC-Transkriptionsfaktors TaNAC2L aus Triticum aestivum (Weizen) wird auch durch hohe Temperaturen induziert, und seine Überexpression in Arabidopsis verbessert seine erworbene Hitzetoleranz durch Regulierung der Expression seiner Hitzestress-bezogenen Gene23. Es gibt jedoch nur begrenzte Hinweise auf die Beteiligung von NAC-TFs an der Regulierung des Thermogedächtnisses. Arabidopsis JUNGBRUNNEN1 (JUB1) ist der einzige NAC-TF, von dem bisher berichtet wurde, dass er das Thermogedächtnis reguliert. Die JUB1-Expression wird durch HS induziert und ihr Expressionsmuster während der Gedächtnisphase ähnelt dem Expressionsmuster anderer Thermogedächtnis-assoziierter Gene, wie z. B. HSFA224. Die Überexpression von JUB1 verbessert das Thermogedächtnis von Arabidopsis-Sämlingen24.

In dieser Studie wollten wir systematisch NAC-TFs identifizieren, die auf das Thermogedächtnis in Arabidopsis reagieren. Wir analysierten die Expressionsmuster fast aller (104) Arabidopsis-NACs nach dem Priming von HS, während der Thermogedächtnisphase und nach dem auslösenden Stimulus. Ein in unserem Screen identifiziertes NAC ist ARABIDOPSIS TRANSCRIPTION ACTIVATOR FACTOR 1 (ATAF1; auch ANAC002 genannt). Es wurde bereits früher festgestellt, dass ATAF1 an den Genregulationsnetzwerken für Seneszenz, Dürre und Zuckersignalisierung beteiligt ist28,29,30,31. Wir fanden heraus, dass die Überexpression von ATAF1 in transgenen Arabidopsis-Pflanzen die Thermogedächtniskapazität einschränkt, während das Ausschalten von ATAF1 das Thermogedächtnis und das Überleben von Pflanzen, die einem stärkeren HS ausgesetzt sind, erheblich verbessert. Um durch ATAF1 regulierte Gene im Thermogedächtnis zu identifizieren, verwendeten wir RNA-seq, um die Hitzereaktionen in Wildtyp-Pflanzen und Mutanten mit veränderten ATAF1-Spiegeln (Überexpressoren und Knockout-Mutanten) zu vergleichen. Wir haben festgestellt, dass ATAF1 zusammen mit ANAC055 exprimiert wird. In Bezug auf das Thermogedächtnis zeigte die Doppelmutante ataf1/anac055 einen ähnlichen Phänotyp wie die einzelnen Knock-out-Mutanten ataf1 und anac055, was darauf hindeutet, dass die beiden TFs das Thermogedächtnis kooperativ regulieren.

Um das Expressionsmuster von NAC-TFs als Reaktion auf HS-Priming und während der Gedächtnisphase zu untersuchen, behandelten wir Arabidopsis-Sämlinge mit einem milden HS (Priming), bevor wir sie einem starken HS (auslösenden Reiz) aussetzten. Wir haben zu mehreren Zeitpunkten nach dem Priming (bis zu 48 Stunden in der Thermomemory-Phase) Proben gesammelt und die Expression von 104 NAC-Genen getestet; Als Kontrollen dienten Sämlinge, die unter unvorbereiteten Bedingungen gehalten wurden (Abb. 1).

Expression von NAC-Transkriptionsfaktoren während der Gedächtnisphase nach Hitzeprimierung. (a) Schematische Darstellung des Hitzestress-Regimes (HS), das zur Beurteilung des HS-Gedächtnisses angewendet wird. (b) Wärmekarte und k-Mittel-Clusterbildung (k = 5 Cluster) von NACs, basierend auf ihrer Expressionsänderung (HS-Proben im Vergleich zu unbelasteten Kontrollen) während der Gedächtnisphase zu den in der Darstellung in (a) angegebenen Zeitpunkten. Die Farbe zeigt das Expressionsverhältnis als log2-fache Änderung für die verschiedenen Zeitpunkte an, wobei „gelb“ eine erhöhte Expression und „lila“ eine reduzierte Expression bezeichnet. Die Liste der Gene in jedem Cluster und ihre Expressionswerte sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt.

Unter Berücksichtigung einer 1,5-fachen Änderung als Grenzwert wurden 75 der NACs beim Priming im Vergleich zur Kontrolle unterschiedlich exprimiert, während die Expression von 29 NAC-Genen in den Gesamtkeimlingsproben nicht nachweisbar war. Der Grenzwert wurde unter Berücksichtigung der Tatsache gewählt, dass selbst moderate Änderungen der TF-Expressionsniveaus starke Downstream-Reaktionen hervorrufen können32. Die Expression einiger NACs (einschließlich z. B. ANAC013 und ANAC029/AtNAP) als Reaktion auf HS-Priming war ähnlich der in einer früheren Studie von Kilian et al.30 berichteten. NACs wurden anhand ihres Expressionsmusters mithilfe von K-Means-Clustering in Cluster gruppiert. Veränderungen in der Expression vieler NACs waren bereits unmittelbar nach der Priming-Behandlung erkennbar (Abb. 1, Ergänzungstabelle S1). Drei Cluster mit insgesamt 33 Genen (Cluster 1, 2 und 3) schienen zu frühen Zeitpunkten hochreguliert und zu späteren Zeitpunkten weitgehend unverändert zu sein (Abb. 1), während 26 Gene (in Cluster 4) zunächst stark herunterreguliert und dann stark hochreguliert waren zu späteren Zeitpunkten (Abb. 1). Für die Gene in Cluster 5 beobachteten wir eine starke Herunterregulierung zum Zeitpunkt 0, also unmittelbar nach Abschluss der 90-minütigen HS, gefolgt von einer starken Hochregulierung innerhalb des Zeitrahmens von bis zu 2 Stunden nach der HS und dann einer moderaten bis unveränderter Ausdruck (Abb. 1). Zusammengenommen zeigten die analysierten NAC-TFs unterschiedliche Expressionsprofile während des HS-Primings und des Gedächtnisses, was auf unterschiedliche Rollen bei der Reaktion auf HS schließen lässt.

Wenn Pflanzen vorher einem mäßigen Stress ausgesetzt werden (Priming), verändert sich ihre Reaktion auf bevorstehenden starken Temperaturstress. Wir haben dies auf molekularer Ebene getestet, indem wir die Transkriptionsreaktion von NAC-TFs untersucht haben. Wir haben getestet, ob Hitzeprimierung die Expression von NACs nach dem auslösenden HS beeinflusst oder nicht. Zu diesem Zweck bestimmten wir die Expression von NAC-TFs nach dem auslösenden Stimulus (T-Pflanzen) und verglichen sie mit der Expression in vorbereiteten und ausgelösten Pflanzen (P + T) unter Verwendung eines 1,5-fachen Änderungsgrenzwerts. Um spezifische Expressionsmuster zwischen P + T- und T-Pflanzen zu identifizieren, wurde ein k-Means-Clustering-Ansatz unter Verwendung von 10 Clustern angewendet (Abb. 2, Ergänzungstabelle S2). Wir stellten fest, dass die Expression der meisten NAC-TFs in geprimten + getriggerten Pflanzen im Vergleich zu Pflanzen, die nur getriggert wurden, induziert wurde. Nur wenige Gene (Cluster 9) zeigten ein entgegengesetztes Expressionsmuster, das in geprimten + getriggerten Pflanzen größtenteils unterdrückt und in nur getriggerten Pflanzen induziert wurde (Abb. 2). ATAF1 zeigte ein besonders interessantes Muster: Seine Expression blieb in Pflanzen nach Priming + Triggerung (P + T) nahezu unverändert, und die Expression wurde unter rein getriggerten Bedingungen (ohne vorheriges Priming) erheblich induziert (Abb. 2, Cluster 9).

Expression von NACs nach einem auslösenden Reiz. (a) Schematische Darstellung der Zeitpunkte, die für die Expressionsanalyse von NACs in ausgelösten Pflanzen (T) und in Pflanzen, die vor dem Auslösen vorbereitet wurden (P + T), verwendet wurden. In getriggerten (T) Pflanzen wurde die Expression als Verhältnis von HS-Proben im Vergleich zu nicht gestressten Kontrollen berechnet. In geprimten und getriggerten (P + T) Pflanzen wurde die Expression als geprimte und getriggerte (P + T) im Vergleich zu nur getriggerten (T) berechnet. (b) K-Mittel-Clustering von NAC-Expressionsprofilen von vorbereiteten und ausgelösten (P + T) und ausgelösten (T) Pflanzen nach dem auslösenden Reiz (k = 10 Cluster). Die Expression der Gene in jedem Cluster wird als Heatmap angezeigt. Die Farbe zeigt den Ausdruck als log2-fache Änderung für die verschiedenen Zeitpunkte an, wobei Gelb einen erhöhten Ausdruck und Lila einen verringerten Ausdruck bezeichnet. Die Liste der Gene in jedem Cluster und ihre Expressionswerte sind in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt.

Um die Hypothese zu testen, dass ATAF1 funktionell an der Thermotoleranz beteiligt ist, wurden zusätzliche physiologische Experimente an ataf1-Mutanten und Pflanzen, die ATAF1 überexprimieren, durchgeführt. Zum Vergleich wurden zwei weitere Gene aus den Clustern 4 (ANAC047/SHYG, AT3G04070) und 8 (ANAC013, AT1G32870) einbezogen.

Um den Einfluss der ausgewählten NAC-Gene auf das Thermogedächtnis zu untersuchen, haben wir ihre funktionelle Beteiligung an dem Prozess bewertet, indem wir den Phänotyp von Überexpressions- und Knockout- (oder Knockdown-)Mutanten als Reaktion auf ein auslösendes HS analysiert haben, das 3 Tage nach dem Hitzepriming (3 Tage Thermogedächtnis) verabreicht wurde ). Wie in der ergänzenden Abbildung S1 gezeigt, unterschieden sich die ANAC013- und SHYG-Überexpressoren, Shyg-Knockout- und Anac013-Knockdown-Linien im Vergleich im Thermomemory-Assay nicht signifikant vom Wildtyp. Allerdings schien ATAF1 am Thermogedächtnis beteiligt zu sein. Eine phänotypische Analyse transgener ATAF1-Pflanzen für das Thermogedächtnis zeigte einen starken Phänotyp, bei dem die ataf1–2- und ataf1–4-Mutanten im Vergleich zu WT-Pflanzen eine signifikant höhere Überlebensrate und Frischmasse aufwiesen, während Pflanzen ATAF1 (im Folgenden ATAF1-OE genannt) überexprimierten ) zeigte ein stark reduziertes Thermogedächtnis (Abb. 3a–c). Als der ataf1–4-Mutant mit einem ATAF1-Allel (pATAF1::ATAF1-GFP) transformiert wurde, das eine ATAF1-GFP-Fusion vom nativen ATAF1-Promotor exprimiert, wurde das Thermogedächtnis auf die Wildtyp-Reaktion zurückgesetzt (ergänzende Abbildung S2). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse auf eine negative regulatorische Rolle von ATAF1 im Thermogedächtnis hin.

Verbessertes Thermogedächtnis in ataf1-Mutanten. (a) Thermomemory-Phänotyp von transgenen ATAF1-Pflanzen. Sämlinge von ATAF1-OE, ataf1-2, ataf1–4 und WT wurden dem in Abb. 1a schematisch dargestellten HS-Regime ausgesetzt. Die Fotos wurden 14 Tage nach dem zweiten HS (auslösenden Reiz) aufgenommen. Dargestellt ist der Phänotyp eines repräsentativen Replikats von mindestens drei unabhängigen biologischen Replikaten. (b,c) Quantifizierung der in (a) gezeigten Ergebnisse. (b) Prozentsatz der Sämlinge in verschiedenen phänotypischen Klassen; Der Thermotoleranz-Phänotyp wurde abhängig vom Ausmaß der Pflanzenerholung in drei Klassen eingeteilt. Die Phänotypklassen sind in Tafel (a) dargestellt. (c) Sämlingsfrischmasse in HS-vorbereiteten und getriggerten Pflanzen im Vergleich zu nicht gestressten Kontrollpflanzen. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar, berechnet aus drei biologischen Replikaten; Jede Wiederholung entspricht der durchschnittlichen Masse von 13 Sämlingen. Signifikante Unterschiede zwischen transgenen und WT-Pflanzen wurden mithilfe des Student-t-Tests berechnet; *zeigt einen P-Wert < 0,05 an.

Da unsere Daten darauf hindeuteten, dass ATAF1 ein negativer Regulator des Thermogedächtnisses ist, versuchten wir, die Rolle von ATAF1 als Reaktion auf einen Hitze-Priming-Stimulus zu verstehen, indem wir seine regulierten Zielgene identifizierten. Zu diesem Zweck wurden WT-, ATAF1-OE- und ataf1–4-Mutantensämlinge mit dem Priming-Stimulus (37 °C für 90 Minuten) behandelt und dann wurden Proben zu drei Zeitpunkten (0 h, 1 h und 4 h; Abb . 4a) nach dem Hitzepriming für die Genexpressionsprofilierung durch RNA-seq. Um den möglichen Einfluss anderer Umweltfaktoren auszuschließen, wurden zu den gleichen Zeitpunkten wie die wärmebehandelten Proben Kontrollproben (nicht vorbereitete Kontrolle) entnommen.

Clustering von RNA-seq-Daten. (a) Schematische Darstellung der Zeitpunkte, die für die Expressionsanalyse durch RNA-seq verwendet werden. (b) Oben: Hierarchische Gruppierung der Proben entsprechend ihrer Ausdrucksmuster. „+“ bezeichnet ATAF1-OE-Linien; „0“ bezeichnet Wildtyp-Col-0; und „−“ bezeichnet ataf1–4. Die Größe der Kreise gibt die seit HS vergangene Zeit an (0, 1 und 4 Stunden nach Hitzestress). Die schwarzen und roten Farben zeigen an, ob die Pflanzen 90 Minuten lang einer Kontroll- oder Wärmetemperaturbehandlung unterzogen wurden. Legende: Farbige Wärmekarte der Pearson-Expressionskoeffizientenprofile zwischen allen möglichen Probenpaaren. Ein teilweises Regenbogenfarbschema von Rot bis Blau zeigt den Bereich der Korrelationswerte an. (c) Diagramm der mehrdimensionalen Skalierung (MDS). Allgemeine Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen Stichproben, basierend auf einer mehrdimensionalen Skalierungsanalyse. Kurz gesagt wurde der euklidische Abstand zwischen allen Proben anhand der Expressionsniveaus aller Gene berechnet und in einem zweidimensionalen Raum dargestellt.

Um die Beziehung zwischen Proben in der RNA-Sequenz zu verstehen, wurde eine hierarchische Clusteranalyse durchgeführt und eine Wärmekarte der Pearson-Korrelationskoeffizienten der Expressionsprofile zwischen allen möglichen Paaren der Proben erstellt (Abb. 4b). Wir beobachteten eine Häufung zwischen biologischen Replikaten, was auf eine hohe Reproduzierbarkeit des Experiments schließen lässt. Die Wärmekarte zeigte auch eine starke Trennung zwischen Proben basierend auf HS-Bedingungen und Genotyp (Abb. 4b). Die allgemeinen Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den Proben wurden durch mehrdimensionale Skalierung (MDS) bestätigt (Abb. 4c), was eine stärkere Trennung nach Zustand (Wärme und Kontrolle) als nach Genotyp unterstützt. Wir stellten auch eine Ähnlichkeit zwischen Proben unter kontrollierter Temperatur und denen nach 4 Stunden Hitzestress fest, was auf eine schnelle Erholung der meisten Veränderungen in der Genexpression schließen lässt. Bemerkenswert ist, dass die Expression von ATAF1 in WT-Sämlingen während der Gedächtnisphase, wie durch RNA-seq gezeigt, dem durch qRT-PCR bestimmten Muster folgte (ergänzende Abbildung S3).

Für alle drei Genotypen fanden wir die höchste Anzahl an differentiell exprimierten Genen (DEGs) zum Zeitpunkt 0, direkt am Ende der 90-minütigen Hitzeprimierungsbehandlung (Abb. 5a). Um HS-assoziierte Priming-Gene zu identifizieren, verwendeten wir dieselben Kriterien, die zuvor von Sedaghatmehr et al.4 verwendet wurden. Wir untersuchten Gene, deren Expression nach dem Priming induziert wurde und zu allen untersuchten Zeitpunkten in der Gedächtnisphase hoch blieb, sowie Gene, deren Expression herunterreguliert war und während der Gedächtnisphase niedrig blieb (Abb. 5a). Zu den DEGs gehören Thermospeicher-assoziierte HSPs4, deren Expression als Reaktion auf Hitzeprimierung in ähnlicher Weise in ATAF1-OE, ataf1–4-Mutante und WT induziert wurde, wie z. B. HSP22, HSP21, HSP17.4 und HSP18.2 (Ergänzungstabelle S3). Dieser Befund bestätigt die Schlussfolgerung, dass diese HSPs zu einer allgemeinen Hitzereaktion beitragen, die allen drei Genotypen gemeinsam ist.

Globale transkriptomische Veränderungen thermogedächtnisassoziierter Gene, die möglicherweise durch ATAF1 reguliert werden. (a) Venn-Diagramme von hitzeinduzierten und hitzereprimierten Genen nach Hitzeprimierung (Hitze relativ zur Kontrolle) in transgenen WT-, ataf1–4-Mutanten- und ATAF1-OE-Pflanzen. (b) Venn-Diagramm der Gene, die in ATAF1-OE hochreguliert und in der ataf1-Mutante herunterreguliert wurden, und umgekehrt, im Vergleich zu WT, als Reaktion auf einen Priming-HS nach 0 h, 1 h oder 4 h. (c) Schematische Darstellung der Position von ATAF1-Bindungsstellen in den Upstream-Regionen der in (b) identifizierten Gene.

Um unterschiedliche Reaktionen von ATAF1-OE- und ataf1–4-Mutantenpflanzen auf Hitzeprimierung zu identifizieren, analysierten wir die RNA-seq-Daten für Gene, die in ATAF1-OE im Vergleich zu WT hochreguliert, in ataf1–4-Mutantenpflanzen jedoch herunterreguliert waren, und umgekehrt ( Abb. 5b). Um potenzielle direkte Zielgene von ATAF1 zu identifizieren, analysierten wir als nächstes die Promotoren unterschiedlich exprimierter Gene entweder auf das Vorhandensein der ATAF1-Bindungsstelle (berichtet von Garapati et al.31) oder auf die Bindung durch ATAF1, wie durch DNA-Affinitätsreinigungssequenzierung bestimmt ( DAP-seq)-Experimente33. Die Analyse wurde für jeden Zeitpunkt nach der Hitzevorbereitung (0 h, 1 h und 4 h) durchgeführt. Insgesamt identifizierten wir 64 Gene als wahrscheinliche direkte ATAF1-Ziele (Ergänzungstabelle S4). Anschließend haben wir unsere Analyse verfeinert, indem wir nach potenziellen Zielgenen gesucht haben, die üblicherweise zu allen drei oder zwei Zeitpunkten nach dem Hitzeprimieren durch ATAF1 reguliert werden. Fünf Gene, nämlich AT2G31260 (ATG9), AT2G41640 (GT61), AT3G44990 (XTH31), AT4G27720 und AT3G23540, wurden zu zwei der drei Zeitpunkte häufig reguliert, was darauf hindeutet, dass es sich möglicherweise um primingassoziierte direkte Ziele von ATAF1 handelt (Abb. 5c); Zu allen drei Zeitpunkten wurde kein Gen reguliert. ATG9 ist ein Autophagie-Gen34 und experimentelle Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Autophagie eine Rolle bei der Reaktion auf Hitzestress spielt35,36. Seine Beteiligung am Thermogedächtnis muss noch bestätigt werden. Die beiden Gene GT61 und XTH31 stehen im Zusammenhang mit der Biosynthese und Expansion der Zellwand. Glykosyltransferase 61 (GT61) gehört zur Familie der Glykosyltransferasen (GT). GT-Proteine haben in Pflanzen vielfältige Funktionen, die meisten davon sind jedoch wahrscheinlich an der Biosynthese von Polysacchariden und Glykoproteinen in der Zellwand beteiligt. In Gräsern, darunter Reis (Oryza sativa) und Weizen (Triticum aestivum), sind Enzyme der GT61-Familie an der Synthese von Xylanen beteiligt, einem der Hauptbestandteile der Zellwand37,38,39. Es wurde noch nicht nachgewiesen, dass GT61 an der Vorbereitung oder Toleranz gegenüber Hitzestress beteiligt ist. XTH31 gehört zur Familie der Xyloglucan-Endotransglucosylase/Hydrolase (XTH). Im Allgemeinen sind Mitglieder der XTH-Familie an der Umgestaltung, Expansion und Morphogenese der Zellwand beteiligt, was auf eine mögliche Rolle bei Stressreaktionen schließen lässt40. Bei Arabidopsis ist XTH31 an der Regulierung des Xyloglucan-Gehalts in der Zellwand beteiligt41. Der xth31-Funktionsverlustmutant weist eine geringere Empfindlichkeit gegenüber ABA auf und die Samen keimen schneller als die des WT41,42. Transgene Sojabohnenpflanzen (Glycine max), die XTH31 aus Arabidopsis überexprimieren, weisen eine erhöhte Toleranz gegenüber Überschwemmungen sowie mehr Adventivwurzeln und längere Primärwurzeln auf43. Die beiden Gene AT4G27720 und AT3G23540 sind nicht gut charakterisiert. AT4G27720 ist für die Kodierung eines Hauptproteins der Facilitator-Superfamilie mit einer Molybdationentransporterfunktion vorgesehen, während AT3G23540 für die Kodierung eines Proteins der Alpha/Beta-Hydrolase-Superfamilie vorgesehen ist. Die α/β-Hydrolase-Enzyme sind an verschiedenen Prozessen beteiligt, darunter Biosynthese, Stoffwechsel, Signaltransduktion, Genregulation44 sowie an der Reaktion und Toleranz der Pflanzen gegenüber Salzstress45.

Gene mit ähnlichen Expressionsmustern haben häufig ähnliche Funktionen und werden möglicherweise durch dieselben Transkriptionsfaktoren reguliert. Um Gene zu identifizieren, die als Reaktion auf Hitzepriming mit ATAF1 koreguliert sind, wurde eine Koexpressionsanalyse unter Verwendung der Transkriptomdaten von ATAF1-OE-, ataf1–4-Mutanten- und WT-Pflanzen unter Kontrollbedingungen und bei Hitzeeinwirkung durchgeführt. Eine gewichtete Korrelationsnetzwerkanalyse wurde verwendet, um Module hochkorrelierter Gene zu finden. Diese Methode wird häufig verwendet, um Beziehungen zwischen Genen zu untersuchen und Genkandidaten für die weitere Analyse zu identifizieren46. Die Koexpressionsanalyse ergab 40 Module in unserem Datensatz (Abb. 6a). Diese Module enthielten Gruppen von Genen, die auf ähnliche Weise exprimiert wurden. Es ist wahrscheinlich, dass Gene, die direkt durch ATAF1 als Reaktion auf Hitze reguliert werden, ähnliche Expressionsmuster aufweisen; Daher haben wir öffentlich verfügbare Daten zu Genen herangezogen, bei denen bereits festgestellt wurde, dass sie potenziell von ATAF1 angegriffen werden (im Allgemeinen, nicht nur durch Hitzestress), und abgefragt, ob diese Gene in unseren Koexpressionsmodulen vorhanden sind. Die öffentlich verfügbaren Daten der potenziellen direkten Ziele wurden mithilfe eines DAP-seq-Assays generiert33. Mutmaßliche Zielgene wurden so bezeichnet, dass sie einen DAP-seq-Peak innerhalb der ersten 1000 bp stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle aufwiesen. Daher haben wir die Liste der Gene, die als direkte Ziele von ATAF1 vorgeschlagen werden (von O'Malley et al.33), mit den Genen verglichen, die in der Koexpressionsanalyse geclustert werden; Wir stellten fest, dass die potenziellen Ziele von ATAF1 in den Koexpressionsclustern 10 und 13 überrepräsentiert waren (Abb. 6b). Diese Cluster mussten weiter untersucht werden, da sie wahrscheinlich direkte Zielgene von ATAF1 als Reaktion auf Hitzestress enthielten. Die Cluster wurden weiter mit den vorgeschlagenen TF-Zielen abgefragt, die mithilfe des von O'Malley et al.33 entwickelten DAP-seq-Assays identifiziert wurden. Wir fanden heraus, dass drei der Cluster (10, 13, 21) eine signifikante Anreicherung der Gene aufwiesen, auf die sowohl ATAF1 als auch ANAC055 abzielen, was darauf hindeutet, dass die Gene in diesen Clustern möglicherweise durch die beiden NACs koreguliert werden (Abb. 6b).

Mögliche Ziele von ATAF1 als Reaktion auf Hitzestress. (a) Das Balkendiagramm zeigt die Anzahl der Gene in jedem Koexpressionscluster. Eine Clusteranalyse wurde mittels gewichteter Genkorrelationsnetzwerkanalyse durchgeführt, die zu 40 gemeinsam exprimierten Genclustern führte. (b) Das Balkendiagramm zeigt den Anteil der ATAF1- und ANAC055-Ziele in jedem Cluster, einschließlich der Gene, auf die beide abzielen. Cluster mit signifikanter Anreicherung der Zielgene ATAF1 und ANAC055 sind schattiert (P < < 0,001); nur zwei Cluster (10 und 13) sind stark mit ATAF1-Zielen angereichert; Die Cluster 10 und 21 sind für ANAC055 deutlich angereichert, und die Cluster 10, 13 und 21 sind für Gene angereichert, auf die beide Transkriptionsfaktoren abzielen.

Unsere Koexpressionsanalyse zeigte, dass ATAF1 und ANAC055 als Reaktion auf HS eine große Anzahl gemeinsamer koexprimierter Ziele aufwiesen (Ergänzungstabelle S5). Wir haben daher getestet, ob ANAC055 auch funktionell an der Regulierung des Thermogedächtnisses beteiligt ist. Zu diesem Zweck untersuchten wir den Thermospeicher-Phänotyp transgener Linien mit veränderter Expression von ANAC055 (Abb. 7a, b). Zwei anac055-Mutanten (anac055-1 und anac055-2) wurden getestet und beide zeigten im Vergleich zu WT einen erheblichen Anstieg des Frischmasseverhältnisses, des Überlebens und des Chlorophyllgehalts, während Pflanzen, die ANAC055 überexprimierten, eine Abnahme dieser Parameter zeigten (Abb. 7b, Ergänzende Abbildung S4). Diese Ergebnisse deuten auf eine negative Rolle von ANAC055 bei der Regulierung des Thermogedächtnisses hin, ähnlich der von ATAF1. Um zu testen, ob ATAF1 und ANAC055 vollständig oder teilweise redundant funktionierten, erzeugten wir eine ataf1/anac055-Doppelmutante, setzten Sämlinge HS aus und verglichen ihre Phänotypen mit den Phänotypen der entsprechenden Einzelgenmutanten. Das Frischmassenverhältnis der ataf1/anac055-Doppelmutante war höher als das des WT, unterschied sich jedoch nicht signifikant von dem der Einzelgen-Knockout-Mutanten ataf1–4 und anac055-1 (Abb. 7c). Dieses Ergebnis zeigt, dass ATAF1 und ANAC055 die Funktion des anderen zur Steuerung des Thermogedächtnisses benötigen.

Das Thermogedächtnis ist im ataf1–4/anac055-Doppel-Knockout-Mutanten im Vergleich zum WT verbessert. (a) Schematische Darstellung des HS-Regimes. (b) Thermomemory-Phänotyp von ANAC055-OE-, anac055-1- und anac055-2-Mutanten und WT-Pflanzen. (c) Thermogedächtnis-Phänotyp von ATAF1-OE-, ataf1–4-Mutanten-, ataf1–4/anac055-Doppelmutanten- und WT-Pflanzen. Sämlinge wurden dem in (a) gezeigten HS-Regime ausgesetzt. Linke Tafel: Sämlinge, fotografiert 14 Tage nach der Einwirkung des auslösenden Hitzestresses. Dargestellt ist der Phänotyp eines repräsentativen Replikats von mindestens drei (b) oder fünf (c) unabhängigen biologischen Replikaten. Rechte Felder: Frischmasse des Sämlings bei Hitzestress im Vergleich zu Kontrollpflanzen (kein Hitzestress). Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar, die aus drei biologischen Replikaten berechnet wurde, wobei jedes Replikat der durchschnittlichen Masse von 18–19 Sämlingen entsprach. Signifikante Unterschiede zwischen transgenen Linien und WT-Pflanzen wurden mithilfe des Student-t-Tests berechnet; * wenn P < 0,05; *** wenn P < 0,001.

HS ist einer der größten abiotischen Stressfaktoren, der sich weltweit negativ auf das Wachstum und die Fortpflanzung von Pflanzen auswirkt. Der Einfluss von HS auf die Pflanzenproduktion nimmt mit dem Klimawandel zu. Eine vorherige Exposition gegenüber mildem HS (Hitzeprimierung) ermöglicht es Pflanzen, eine Toleranz gegenüber HS zu erlangen und aufrechtzuerhalten, indem ein zelluläres Gedächtnis eines früheren HS aufgebaut wird (Thermogedächtnis)1,2,3,4. Hier haben wir die Rolle von NAC-TFs im Thermogedächtnis untersucht. Wir fanden heraus, dass mehrere NACs nach Hitzestress deutlich auf ihrer Expressionsebene reagierten und dass die Expressionsänderungen während der Gedächtnisphase anhielten. Diese Ergebnisse ähneln denen, die für das Expressionsmuster anderer Thermogedächtnis-assoziierter Gene während der Gedächtnisphase (wie HSFA2, HSA32 und JUB1) berichtet wurden8,9,24.

Anschließend analysierten wir die Expression von NAC-TFs nach dem auslösenden Reiz (zweiter Hitzestress), um zu untersuchen, ob ihre Expression durch eine Priming-Behandlung beeinflusst wurde. Unsere Daten zeigen, dass die NAC-Expression nach dem auslösenden Reiz verändert wurde, was auf das Vorhandensein eines Transkriptionsgedächtnisses hinweist, das ihre Expression steuert. Ein ähnliches Expressionsmuster wurde zuvor für das Dürregedächtnis berichtet, bei dem sich die Expression einer Untergruppe von DEGs nach einem zweiten Dürrestress verändert. Ding et al.47 klassifizierten die Gedächtnisgene in vier verschiedene Gruppen, die jeweils unterschiedliche Expressionsmuster zeigten: Gene mit erhöhtem (oder verringertem) Expressionsniveau nach einem ersten Stress und einem weiter erhöhten (oder verringerten) Expressionsniveau nach einem zweiten Stress, den sie jeweils bezeichnet als (+/+ bzw. −/−); „revidierte Gedächtnisgene“, die nach einem ersten Stress induziert und dann nach dem zweiten Stress verringert werden (+/−) oder das Gegenteil (−/+). Viele NACs zeigten ein ähnliches Expressionsmuster wie von Ding et al.47.

Wir fanden heraus, dass die ATAF1 (ANAC002)-Expression unmittelbar nach dem Priming-HS schnell ansteigt und dann während der Gedächtnisphase auf unter die Kontrollwerte abfällt (Abb. 1; Cluster 2). Wir fanden außerdem heraus, dass ataf1-Knockout-Mutanten gegenüber Hitzestress toleranter waren als der Wildtyp, was auf eine negative regulatorische Rolle von ATAF1 im HS-Gedächtnis schließen lässt. ATAF1 wurde zuvor als wichtiger Regulator der Seneszenz und der Reaktion auf Trockenstress identifiziert29,31,48. Es ist gut erwiesen, dass ATAF1 die Seneszenz fördert, indem es die Expression von zwei TFs, die an der Seneszenz und der Aufrechterhaltung der Chloroplasten beteiligt sind, direkt reguliert: ANAC092 (ORE1) und GOLDEN2-LIKE1 (GLK1)31. ATAF1 reguliert auch die Reaktion auf Dürre, indem es die Expression von 9-CIS-EPOXYCAROTENOID DIOXYGENASE 3 (NCED3) reguliert, das ein Schlüsselenzym der ABA-Biosynthese kodiert31,49.

Wir verwendeten die RNA-seq-Analyse, um frühe, durch ATAF1 kontrollierte Transkriptionsänderungen zu identifizieren. Es wurden bereits mehrere Mechanismen (Gene) identifiziert, die an der basalen Hitzetoleranz beteiligt sind: Dazu gehören die ROS-Entgiftung, die Lipidsignalisierung und die Aktivierung von Hitzeschockproteinen und Hitzeschockfaktoren8,9,10,27,50. Unsere Daten fanden ähnliche Reaktionen in ATAF1-OE-, ataf1–4-Mutanten- und WT-Pflanzen, wo diese Mechanismen ähnlich aktiviert wurden.

Die Koexpressionsanalyse hat sich als leistungsstarkes Instrument zur Identifizierung von TF-Zielgenen etabliert51,52. Beispielsweise führten Jensen et al.49 eine Koexpressionsanalyse über öffentlich verfügbare Microarray-Datensätze durch und identifizierten 25 mit ATAF1 koexprimierte Gene. Die Promotorregionen dieser ATAF1-Coexpressoren waren hinsichtlich der ATAF1-Bindungsstellen deutlich angereichert. Wir führten eine Koexpressionsanalyse durch und kombinierten diese Informationen mit öffentlich verfügbaren Daten aus einem DAP-seq-Ansatz33. Wir fanden heraus, dass vier Koexpressionscluster mit vorhergesagten ATAF1-Zielgenen angereichert waren; und diese wurden auch mit Zielgenen eines anderen NAC-TF, ANAC055, angereichert. Wir fanden viele Zielgene, die üblicherweise durch ATAF1 und ANAC055 reguliert werden, was auf eine zumindest teilweise Überlappung zwischen den beiden TFs hinsichtlich ihrer Regulierungskapazität hindeutet. TFs agieren häufig redundant. Beispielsweise fungieren die Transkriptionsfaktoren WRKY11 und WRKY17 als negative Regulatoren der Grundresistenz gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate (Pst)50. Der Funktionsverlust von WRKY11 erhöht die Resistenz gegenüber Pst. Eine Expressionsanalyse ausgewählter Gene in Einzel- und Doppelmutanten ergab, dass beide TFs Transkriptionsänderungen als Reaktion auf eine Pathogeninfektion modulieren; Allerdings wirkte jeder von ihnen je nach spezifischem Zielgen entweder spezifisch oder teilweise redundant50. In unserer Arbeit haben wir ATAF1 und ANAC055 als negative Regulatoren der Thermotoleranz identifiziert. Phänotypische und Genexpressionsdaten von Einzel- und Doppelmutanten von ataf1 und anac055 zeigten eine teilweise regulatorische Redundanz zwischen ATAF1 und ANAC055.

Unsere Ergebnisse legen nahe, dass ATAF1 und ANAC055 beide als negative Regulatoren des Thermogedächtnisses wirken, weil (i) die einzelnen ataf1- und anac055-Mutanten sowie die doppelt mutierten Pflanzen einen ähnlichen Phänotyp im Thermogedächtnis aufweisen, (ii) sie scheinbar co-exprimiert werden, und (iii) ihre potenziellen Zielgene überschneiden sich. Weitere Proteininteraktionsstudien sind erforderlich, um zu testen, ob ATAF1 und ANAC055 auch physikalisch interagieren, beispielsweise als Heterodimere, oder ob sie nur über ihre genregulatorischen Netzwerke verbunden sind. Diese Interaktion muss in einem zeitlichen und räumlichen Kontext untersucht werden, um ihre Relevanz für das Thermogedächtnis zu bewerten.

Kürzlich wurde vermutet, dass der durch Hitze induzierbare Transkriptionsfaktor HSFA2 am Thermogedächtnis beteiligt ist, insbesondere an der Regulierung der HS-Gedächtnisgene im Spross-Apikalmeristem (SAM), was darauf hindeutet, dass die Etablierung des Thermogedächtnisses organspezifische Mechanismen beinhaltet53,54. Unsere Ergebnisse zeigen, dass in den ataf1–4-Linien ein höherer Anteil der Pflanzen eine vollständige Erholung zeigte, dh Sämlinge und Keimblätter blieben im Vergleich zu WT-Pflanzen grün. Bei Pflanzen, die sich nur teilweise erholten, blieben die Keimblätter gebleicht und die sich entwickelnden echten Blätter erschienen grün (ergänzende Abbildung S4). Die grünen Blätter legen nahe, dass Mechanismen zum Schutz des SAM, wo sich neue Blätter entwickeln, eine Rolle beim Thermogedächtnis spielen.

Die meisten aktuellen Erkenntnisse über Thermotoleranz und Thermopriming basieren auf Arabidopsis-Sämlingen. Es wurden jedoch nur begrenzte Studien zur Bewertung des Thermoprimings bei Kulturpflanzen durchgeführt. Beispielsweise steigerte die Hitzevorbereitung von Winterweizen während der Stängelverlängerungs-, Schoss- und Anthesephase den Kornertrag unter Hitzestress während der Kornfüllphase deutlich55. Ein weiterer Mechanismus zur Verbesserung der Thermotoleranz könnte durch Wurzelendophyten entstehen, die offenbar die Thermotoleranz von Nutzpflanzen verbessern, indem sie die Expression des Thermogedächtnis-assoziierten Gens HSFA256 beeinflussen. Unsere Studie zeigt die Bedeutung von zwei Genen, ATAF1 und ANAC055, als negative Regulatoren des Thermogedächtnisses in Sämlingen; Es muss noch getestet werden, ob späteres Wachstum oder Samenertrag auch unter rekursivem HS verändert werden. Zumindest bei den hier getesteten Sämlingen wurde kein Biomasseverlust unter Nicht-Stress-Bedingungen beobachtet. Sobald ein besseres Verständnis des Thermogedächtnisses in Modellorganismen und Nutzpflanzen etabliert ist, könnte die Genom-Editierungstechnologie eingesetzt werden, um die Nutzpflanzenleistung auf dem Feld unter erwarteten zukünftigen klimatischen Bedingungen zu verbessern.

Der Arabidopsis thaliana-Ökotyp Col-0 wurde als Wildtyp verwendet und vom European Arabidopsis Stock Centre (NASC) (http://arabidopsis.info/) bezogen. Die Samen ATAF1-OE, ataf1-2 (SALK-057618) und ataf1–4 (GABI-Kat GK565H08) wurden zuvor in Garapati et al.31 beschrieben. Samen der T-DNA-Insertionslinien von ANAC055 (anac055-1; SALK_014331 und anac055-2; SALK_011069) wurden aus der Samensammlung des European Arabidopsis Stock Centre (NASC) (http://arabidopsis.info/) bezogen. Die transgenen ANAC047-Linien, d. h. ANAC047-OE (35S::ANAC047-GFP) und die beiden Knockout-Linien (T-DNA-Insertionslinien shyg-1/SALK-066615 und shyg-2/GABI-Kat GK-343D11) waren zuvor beschrieben von Rauf et al.57. Samen der Linien ANAC013-OE und Knockdown (anac013-kd) wurden von Prof. Frank van Breusegem (Universität Gent, Gent, Belgien) bereitgestellt und in De Clercq et al.58 beschrieben.

Für 35S::ANAC055 (ANAC055-OE) wurde der offene Leserahmen von ANAC055 durch PCR aus Arabidopsis Col-0-Blatt-cDNA amplifiziert und in pUni/V5-His-TOPO (Invitrogen) eingefügt. Die cDNA wurde dann über hinzugefügte PmeI-PacI-Stellen in einen modifizierten Pflanzentransformationsvektor pGreen0229-35S kloniert59. Der resultierende pGreen0229-35S::ANAC055-Vektor wurde in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 elektroporiert und über Blumendip in den Arabidopsis-Wildtyp transformiert. Um pATAF1::ATAF1-GFP zu konstruieren, wurde ein genomisches Fragment, das den 1,5-kb-ATAF1-Promotor und die ATAF1-Kodierungsregion (ohne das Translationsstoppcodon) umfasst, stromaufwärts der Kodierungssequenz für das grün fluoreszierende Protein (In-Frame-Fusion) in Plasmid pK7FWG2 eingefügt .060. Durch die Klonierung wurde der im Plasmid vorhandene CaMV 35S-Promotor durch den ATAF1-Promotor ersetzt. Die ataf1-Knockout-Komplementationslinie wurde durch Transformation des ataf1–4-Mutanten31 mit dem pATAF1::ATAF1-GFP-Konstrukt erzeugt.

Die ataf1/anac055-Doppel-Knockout-Mutante wurde durch Kreuzung der homozygoten ataf1–4-Mutante mit der homozygoten anac055-1-Mutante erzeugt. Pflanzen der F2-Generation wurden einem PCR-Screening unterzogen, um homozygote doppelt mutierte Pflanzen auszuwählen. Die Liste der für die Genotypisierung verwendeten Primer ist in der Ergänzungstabelle S6 aufgeführt.

Arabidopsis-Samen wurden durch 2-minütiges Waschen mit 70 % Ethanol oberflächensterilisiert; Die Ethanollösung wurde dann durch 20 %iges Natriumhypochlorit ersetzt und die Samen wurden 20 Minuten lang unter kontinuierlichem Schütteln in der Lösung inkubiert. Anschließend wurden die Samen viermal mit sterilem Wasser gewaschen und auf sterilisiertem Filterpapier in einer laminaren Reinbank trocknen gelassen. Ungefähr die gleiche Anzahl von Samen (etwa 500 Samen) wurde auf kleinen Petrischalen gekeimt, die Murashige- und Skoog-Medium (MS) halber Konzentration, ergänzt mit 1 % (Gew./Vol.) Saccharose, enthielten. Zur Schichtung wurden die Platten zwei Tage lang in einem dunklen Kühlraum (8 °C) aufbewahrt, bevor sie in eine Wachstumskammer gestellt wurden (Photoperiode 16 h/8 h: hell/dunkel bei 22,5 °C, unter 120 μmol m−2 s−). 1-Photonen-Bestrahlungsstärke). Für HS-Tests wurden fünf Tage alte Sämlinge verwendet.

Für die NAC-Expressionsprofilierung wurden 5 Tage alte Arabidopsis-Sämlinge einem HS-Regime ausgesetzt. Die Pflanzen wurden 90 Minuten lang in einer Wachstumskammer einem milden Hitzestress bei 37 °C ausgesetzt und kehrten anschließend in den normalen Wachstumszustand zurück, um sich zwei Tage lang zu erholen und ihr Thermogedächtnis zu beurteilen. Anschließend wurden die Pflanzen 45 Minuten lang einer auslösenden HS-Temperatur von 44 °C ausgesetzt. Arabidopsis-Sämlinge wurden während der Gedächtnisphase und nach dem auslösenden Reiz zu den in Abb. 1 angegebenen Zeitpunkten gesammelt. Ganze Sämlinge, die von einer einzelnen Platte gesammelt wurden, wurden als ein biologisches Replikat betrachtet. Gleichzeitig wurden Kontrollproben (ohne Behandlung) entnommen, um zirkadiane Effekte zu reduzieren. Drei biologische Replikate pro Behandlung, pro Zeitpunkt und pro Genotyp wurden analysiert. Die Proben wurden direkt in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Analyse bei –80 °C gelagert.

Der Chlorophyllgehalt wurde unter Verwendung des Protokolls von Hiscox und Israelstam61 gemessen. Zehn gefrorene Sämlinge wurden in 0,5 ml vorgewärmtes Dimethylsulfoxid (DMSO, 65 °C) getaucht und 20 Minuten bei 65 °C inkubiert. Für die Messung wurde der Extrakt 1:10 oder 1:100 mit DMSO verdünnt. Die Absorption wurde für Chlorophyll a und b bei 663 nm bzw. 645 nm aufgezeichnet. Die folgende Formel62 wurde verwendet, um die Konzentration von Chlorophyll a, b und Gesamtchlorophyll in mg g−1 Frischmasse (FM) zu berechnen:

Die Daten wurden auf die jeweilige Kontrolle jedes Genotyps normalisiert.

Zur Expressionsprofilierung von NAC-Genen wurde die Gesamt-RNA mit Trizol (Ambion, Life Technologies) extrahiert, gefolgt von der Reinigung der RNA mit Säulen des PureLink RNA Mini-Kits (Ambion, Life Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die RNA-Konzentration wurde mit einem NanoDrop-Spektrophotometer (Thermo Scientific) gemessen; Genomische DNA wurde mit dem TURBO DNA-free Kit (Ambion) gemäß den Anweisungen des Herstellers verdaut. Das Fehlen einer genomischen DNA-Kontamination wurde durch qRT-PCR unter Verwendung intronspezifischer Primer des Kontrollgens AT5G65080 bestätigt (Primersequenzen siehe Ergänzungstabelle S6). cDNA wurde aus 4 µg hochwertiger RNA unter Verwendung des Revert Aid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert.

Die qRT-PCR-Reaktion wurde mit SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) durchgeführt: cDNA 0,5 μL, SYBR Green Master Mix (2×) 2,5 μL, Forward- und Reverse-Primer-Mix (jeweils 0,5 μM) 2 μL. Die Reaktionen wurden in einem ABI PRISM 7900 HT-Sequenzerkennungssystem (Applied Biosystems) unter Verwendung des folgenden Protokolls inkubiert: Die Temperatur wurde zunächst auf 95 °C eingestellt und 10 Minuten lang konstant gehalten und anschließend einer Reihe von 40 Zyklen bei 95 °C unterzogen für 15 s und 60 °C für 1 min. Als Referenzgen für die Datenanalyse wurde ACTIN2 (AT3G18780) verwendet. Die Primerplattform der 104 Arabidopsis NAC TF-Gene wurde mit dem QuantPrime-Tool63 erstellt. Die Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle S6 angegeben. Nach 40 Reaktionszyklen wurde eine Schmelzkurve durch Erhöhung der Temperatur von 60 auf 95 °C mit einer Rampengeschwindigkeit von 1,9 °C min−1 erstellt, um die Amplifikation der gewünschten Produkte zu überprüfen. Die Effizienz der Reaktion wurde mithilfe der LinRegPCR-Software geschätzt, wie von Caldana et al.64 beschrieben.

Die Daten wurden mit der vergleichenden Ct-Methode analysiert, wie in Kamranfar et al.65 beschrieben. Kurz gesagt, der Delta-Ct-Wert (ΔCt) wurde berechnet, indem jeder Ct-Wert mit dem Ct-Wert des Referenzgens ACTIN2 normalisiert wurde. Dann wurde der Grad der Genexpression als Differenz zwischen einem willkürlichen Wert von 40 und dem ΔCt-Wert ausgedrückt (ein hoher 40-ΔCt-Wert weist auf einen hohen Grad der Genexpression hin). Zur Auswahl unterschiedlich exprimierter Gene wurde ein Schwellenwert von 1,5-facher Veränderung verwendet.

Für die RNA-seq-Analyse wurden 5 Tage alte Arabidopsis-Sämlinge der drei Genotypen verwendet: WT, ataf1–4-Mutante und ATAF1-OE. Nach der Behandlung mit der Hitzeprimierungstemperatur (37 °C für 90 Minuten) wurden die Sämlinge zu den Zeitpunkten 0 h, 1 h und 4 h während der Gedächtnisphase geerntet.

Die Transkriptome der drei Genotypen WT, ataf1–4 und ATAF1-OE wurden mithilfe der RNA-seq-Technologie analysiert. Gesamt-RNA wurde aus 5 Tage alten Arabidopsis-Sämlingen der drei Genotypen isoliert. Ganze Sämlinge, die von jeder Platte gesammelt wurden (Pool von mindestens 10 Sämlingen), wurden als ein biologisches Replikat betrachtet. Es wurden drei biologische Replikate pro Behandlung, pro Zeitpunkt und pro Genotyp verwendet, was insgesamt 72 Proben ergab. Die RNA wurde mit Direct-zol RNA MiniPrep Plus (Zymo Research, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die Qualität wurde mit einem Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbrann, Deutschland) bewertet und die Quantität mit Qubit (Invitrogen, Life Technologies) bestimmt. Zur Vorbereitung der Bibliotheken für die Sequenzierung wurde hochwertige RNA (3 µg) verwendet. 150-bp-Paired-End-Bibliotheken (PE) für die RNA-Sequenzierung wurden aus mit mRNA angereicherten Proben unter Verwendung des NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit für Illumina-Sequenzierung (New England Biolabs) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Insgesamt 12 Proben wurden in einer Spur der Durchflusszelle gepoolt. Die RNA wurde mit einem Illumina HiSeq4000-Gerät bei KAUST Core Labs sequenziert.

HISAT wurde verwendet, um die RNA-seq-Reads auf das Genom von Arabidopsis thaliana (TAIR10) auszurichten66. Es wurden nur Sequenzierungsablesungen beibehalten, die eindeutig auf dem Genom abgebildet waren. Htseq-count wurde verwendet, um die Anzahl der Sequenzierungslesungen der Transkripte zu zählen67. VOOM, eine Transformationsmethode, die die Verwendung von RNA-seq-Daten für das lineare Modellgerüst ermöglicht, wurde zur Berechnung der Transkripthäufigkeit verwendet, und Quantilnormalisierung wurde verwendet, um die Häufigkeitsverteilung zwischen Proben zu normalisieren68. EdgeR und LIMMA69,70 wurden als Rahmen für die Berechnung der unterschiedlich exprimierten Gene verwendet. R, eine allgemeine Statistikumgebung, wurde zur Datenverwaltung, Analyse und Generierung von Zahlen verwendet71.

Der angepasste lineare Kontrast wurde eingerichtet, um die unterschiedliche Expression zwischen Genotypen oder Temperaturen zu berechnen. Genauer gesagt wurden Interaktionseffekte zweiter Ordnung mithilfe des Kontrastrahmens70 berechnet. Beispielsweise könnte eine Berechnung durchgeführt werden, um die Veränderungen der Genexpression unter Hitze im Vergleich zur Kontrolle für ataf1 und WT quantitativ zu bewerten: (heatataf1 − controlataf1) − (heatWT − controlWT). Alle Grenzwerte für die statistische Signifikanz wurden für mehrere Tests angepasst, indem die False Discovery Rate (Benjamini-Hochberg) mithilfe von „decideTests“ (…, method = „global“, adjust.method = „BH“, p.value = „) auf 0,0572 kontrolliert wurde. 0,05", lfc = 0.

Für alle Gene und Proben wurde eine gewichtete Genkorrelationsnetzwerkanalyse durchgeführt, um Gruppen koexprimierter Gene46 unter Verwendung von Standardparametern zu identifizieren. Der Soft-Thresholding-Leistungsparameter wurde auf 6 eingestellt. Dies ist der Wert, der auf einer grafischen Untersuchung basiert und bei dem die optimalen Netzwerkbedingungen erfüllt sind (maximaler skalenfreier Anpassungsindex und minimale mittlere Konnektivität). Für die mehrdimensionale Skalierung wurde die cmscale-Funktion in R verwendet.

Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen (TFBS), die über DAP-seq erworben wurden, wie von O'Malley et al.33 berichtet, wurden aus der öffentlich zugänglichen Pflanzen-Cistrom-Datenbank extrahiert. Die Peaks des DAP-seq-Bindungsmotivs wurden im NarrowPeak-Format extrahiert und dem Arabidopsis-Genom zugeordnet. Die Entfernung vom Peak-Standort zum nächstgelegenen Transkriptionsstartort (TSS) wurde dann über den Bedtools-Befehl „closest“73 berechnet, wobei die TSS-Standorte aus der TAIR 10-Annotationsdatei74 übernommen wurden. Mutmaßliche ATAF1- und ANAC055-Zielgene wurden so definiert, dass sie mindestens einen DAP-seq-Peak innerhalb der ersten 1000 bp stromaufwärts der jeweiligen TSSs aufwiesen. Eine statistische Analyse zur Anreicherung von Zielgenen innerhalb der Koexpressionscluster wurde in R durchgeführt, wobei ein hypergeometrischer Test auf Überrepräsentation71 verwendet wurde.

Die experimentelle Forschung und Feldstudien zu Pflanzenmaterialien entsprechen den relevanten institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien und Gesetzen.

RNA-Sequenzierungsdaten sind in der NCBI Bioproject-Datenbank unter der ID SUB8978006 (https://ngdc.cncb.ac.cn/search/?dbId=gsa&q=SUB8978006) verfügbar. Alle anderen während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

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Die Forschung wurde durch Mittel der King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), Saudi-Arabien, unterstützt. NOA erhielt Unterstützung durch ein L'Oréal-UNESCO For Women in Science 2014 Middle East Fellowship. SMS wurde gefördert vom Ministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst Baden-Württemberg (Az: 75533-30-20/1). BMR dankt der Universität Potsdam und SB dankt dem Max-Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie für finanzielle Unterstützung. BMR dankt dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union, Projekt PlantaSYST (SGA-CSA Nr. 739582 unter FPA Nr. 664620) für die Finanzierung. TDW dankt der International Max Planck Research School „Primary Metabolism and Plant Growth“, Potsdam, für finanzielle Unterstützung. Die Autoren danken Prof. Frank van Breusegem (Universität Gent, Gent, Belgien) für die Bereitstellung von Samen der Linien ANAC013-OE und Knockdown (anac013-kd).

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Annapurna Devi Allu

Aktuelle Adresse: Department of Biology, Indian Institute of Science Education and Research (IISER), Tirupati, Indien

Abteilung für Biochemie, Fakultät für Naturwissenschaften, König-Abdulaziz-Universität, Jeddah, Saudi-Arabien

Nouf Owdah Alshareef

Abteilung für Bio- und Umweltwissenschaften und Ingenieurwesen (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), Thuwal, Saudi-Arabien

Nouf Owdah Alshareef, Yong H. Woo, Mark Tester & Sandra M. Schmöckel

Abteilung Physiologie der Ertragsstabilität, Institut für Nutzpflanzenwissenschaften, Universität Hohenheim, Fruwirthstr. 21, 70599, Stuttgart, Deutschland

Sophie L. Otterbach & Sandra M. Schmöckel

Max-Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie, 14476, Potsdam-Golm, Deutschland

Annapurna Devi Allu, Tobias de Werk, Iman Kamranfar, Bernd Mueller-Roeber und Salma Balazadeh

Institut für Biochemie und Biologie, Universität Potsdam, 14476, Potsdam-Golm, Deutschland

Iman Kamranfar & Bernd Müller-Roeber

Zentrum für Pflanzensystembiologie und Biotechnologie (CPSBB), 139 Ruski Blvd., 4000, Plovdiv, Bulgarien

Bernd Müller-Röber

Institut für Biologie, Universität Leiden, Sylviusweg 72, 2333 BE, Leiden, Niederlande

Salma Balazadeh

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SB, BMR, SMS und MT haben die Forschung konzipiert. NOA führte die Experimente durch und erfasste die experimentellen Daten. SLO führte einen Teil der Phänotypisierung durch und bestimmte die Chlorophyllwerte. NOA, YHW, TDW, SB und SMS führten Datenanalysen durch. IK erzeugte die Komplementationslinie von ataf1–4. ADA überwachte qRT-PCR-Experimente. Alle Autoren haben zur Interpretation der Daten beigetragen. SB, BMR und MT haben Finanzmittel erhalten. NOA, SB und SMS verfassten den Entwurf des Manuskripts, das von SB, SMS und BMR fertiggestellt wurde. Alle Autoren überprüften und genehmigten das endgültige Manuskript.

Korrespondenz mit Salma Balazadeh oder Sandra M. Schmöckel.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Alshareef, NO, Otterbach, SL, Allu, AD et al. Die NAC-Transkriptionsfaktoren ATAF1 und ANAC055 beeinflussen die Hitzestressreaktion bei Arabidopsis. Sci Rep 12, 11264 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14429-x

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Eingegangen: 11. Mai 2021

Angenommen: 07. Juni 2022

Veröffentlicht: 04. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14429-x

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Die NAC-Transkriptionsfaktoren ATAF1 und ANAC055 beeinflussen die Hitzestressreaktion bei Arabidopsis