Erforschung von Sauerstoff

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 18243 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die mikrobiologische Sicherheit von Medizinprodukten ist für Patienten und Hersteller gleichermaßen von größter Bedeutung. Während des Gebrauchs werden medizinische Geräte jedoch unweigerlich mit Mikroorganismen, einschließlich opportunistischer Krankheitserreger, kontaminiert. Dies stellt insbesondere dann ein Problem dar, wenn diese Geräte mit Körperstellen in Kontakt kommen, die eine hohe Bakterienbelastung aufweisen, wie zum Beispiel der Mundhöhle. In der vorliegenden Studie haben wir untersucht, ob hohe Sauerstoffkonzentrationen zur Desinfektion von Oberflächen angewendet werden können, die mit verschiedenen grampositiven und gramnegativen Bakterien kontaminiert sind. Wir zeigen, dass einige opportunistische Krankheitserreger, am Beispiel Pseudomonas aeruginosa, besonders empfindlich auf Sauerstoffkonzentrationen über der atmosphärischen Sauerstoffkonzentration von 21 % reagieren. Unsere Beobachtungen zeigen auch, dass hohe Sauerstoffkonzentrationen angewendet werden können, um die Belastung von Verneblern mit P. aeruginosa zu reduzieren, die von Mukoviszidose-Patienten verwendet werden, die besonders anfällig für die Besiedlung und Infektion durch dieses Bakterium sind. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Wirksamkeit der sauerstoffvermittelten Desinfektion von der Bakterienart, der Dauer der Sauerstoffexposition und der Sauerstoffkonzentration abhängt. Wir halten diese Beobachtungen für relevant, da Gasmischungen mit hohem Sauerstoffgehalt problemlos zur mikrobiellen Dekontamination eingesetzt werden können. Die größte Herausforderung bei sauerstoffbasierten Desinfektionsansätzen liegt jedoch in einer möglicherweise unvollständigen Eliminierung mikrobieller Kontaminanten, weshalb eine kombinierte Anwendung mit anderen Desinfektionsmitteln wie Ethanol oder Wasserstoffperoxid empfehlenswert ist.

Die Beseitigung potenziell pathogener Mikroorganismen aus medizinischen Geräten durch Desinfektion oder Sterilisation ist eine entscheidende Anforderung, die von den Herstellern erfüllt werden muss, um die Patientensicherheit und die Einhaltung der Standards der Gesundheitsbehörden zu gewährleisten. Laut den Centers of Disease Control and Prevention (CDC) ist Sterilisation definiert als „die vollständige Eliminierung oder Zerstörung aller Formen mikrobiellen Lebens, die in Gesundheitseinrichtungen entweder durch physikalische oder chemische Mittel erreicht wird“. Sterilisation ist daher nicht mit Desinfektion zu verwechseln, die definiert ist als „ein Prozess, der viele oder alle Mikroorganismen mit Ausnahme von Bakteriensporen eliminiert“1,2.

Es gibt mehrere Methoden zur Desinfektion oder Sterilisation, die in der täglichen Praxis angewendet werden, je nach der Notwendigkeit, mikrobielle Verunreinigungen zu beseitigen, und den Eigenschaften der zu dekontaminierenden Geräte2,3. Ozongas wird derzeit als praktikable Alternative zu herkömmlichen Desinfektionsmitteln eingesetzt und ist besonders wirksam in Umgebungen, in denen sich die Verwendung flüssiger Desinfektionsmittel mit bestimmten Biomaterialien als unverträglich erweisen kann4. Andere gängige Desinfektionsmethoden basieren auf der Verwendung anderer oxidativer Mittel wie Natriumhypochlorit, Povidon-Jod, Wasserstoffperoxid oder Peressigsäure5. Alternative Optionen basieren auf der Verwendung von Alkohol, Chlorhexidin, quartären Ammoniumverbindungen oder Glutaraldehyd5. Um eine vollständige Eliminierung der Sporen zu erreichen, werden Autoklavieren, Ethylenoxid, Wasserstoffperoxiddämpfe oder Plasma bevorzugt5,6. Insbesondere verdampftes Wasserstoffperoxid wird in großem Umfang zur Sterilisation medizinischer Geräte verwendet und stellt eine wichtige Säule für nicht-thermische Gassterilisationsansätze dar7.

Die „Spaulding-Klassifizierung“ hilft bei der Auswahl geeigneter mikrobiologischer Dekontaminationsstufen, was insbesondere bei wiederverwendbaren Medizinprodukten hilfreich ist8. Das Infektionsrisiko für den Patienten, der ein Medizinprodukt verwendet, bestimmt die Auswahl eines geeigneten Verfahrens zur Dekontamination. Konkret definierte Spaulding drei verschiedene Klassifizierungen für Medizinprodukte, nämlich kritisch, halbkritisch und nicht kritisch. Zu den kritischen Medizinprodukten gehören Geräte, die in steriles Gewebe eindringen oder damit in Kontakt kommen, zu semikritischen Geräten gehören Geräte, die mit Haut oder Membranen in Kontakt kommen, ohne diese zu durchdringen, und zu den unkritischen Geräten gehören schließlich Geräte, die nur intakte Haut berühren, aber nicht keine Schleimhäute8. Diese drei Kategorien werden entsprechend der Schwere des Infektionsrisikos zugeordnet8,9.

Ein klinischer Zustand, der Patienten besonders anfällig für mikrobielle Besiedlung und opportunistische Infektionen macht, ist Mukoviszidose (Mukoviszidose), eine Erbkrankheit, die aufgrund von Mutationen im CF-Transmembran-Leitfähigkeitsregulatorprotein zu einer abnormalen Ansammlung von Schleim in der Lunge führt10,11. Infolgedessen haben CF-Patienten eine erhöhte Veranlagung für die Besiedlung der Atemwege und Infektionen durch opportunistische bakterielle Krankheitserreger. Ein Beispiel für einen Krankheitserreger, der sich die Schleimansammlung in den Atemwegen von CF-Patienten zunutze macht, ist Pseudomonas aeruginosa12. Dieses Bakterium ist ein nicht sporulierender aerober Krankheitserreger von besonderer klinischer Relevanz, der für eine Reihe von Infektionen der Atemwege, der Harnwege und der Operationsstelle sowie für Bakteriämie verantwortlich ist13. Die Behandlung von CF-Patienten, die an P. aeruginosa leiden, beruht auf der Inhalation von Antibiotika wie Colistin, Tobramycin, Aztreonam oder Levofloxacin14. Da die langfristige Verabreichung von Antibiotika bakterielle Resistenzen hervorrufen kann, ist es wichtig, die Exposition des Patienten gegenüber P. aeruginosa zu minimieren. Dementsprechend besteht Bedarf an einfachen Verfahren zur Entfernung dieses Erregers aus Inhalationsgeräten, die CF-Patienten täglich verwenden. Darüber hinaus werden Geräte wie Vernebler im Allgemeinen zu Hause verwendet, was benutzerfreundliche Dekontaminationsprotokolle erfordert, die keine giftigen Reagenzien oder komplizierten Geräte erfordern. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass dies durch eine Ozonbehandlung für nur 5 Minuten erreicht werden kann15.

Ein potenziell attraktives Desinfektionsverfahren für den Heimgebrauch könnte auf der bakteriellen Exposition gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) basieren. Zu diesen ROS gehören hochreaktive Radikale, Peroxide und Superoxide, die aus molekularem Sauerstoff (O2) stammen und Bakterienzellen tödlich schädigen16,17. Die bakterizide Wirkung von ROS zeigt sich jedoch nur dann, wenn ein Ungleichgewicht zwischen der Sauerstoff-/ROS-Exposition und der bakteriellen antioxidativen Abwehr besteht18,19. Beispielsweise sind viele Bakterien in der Lage, die zerstörerischen Auswirkungen von Sauerstoff und ROS durch den Einsatz spezifischer Enzyme wie Katalasen, Peroxidasen und Superoxiddismutasen zu mildern17. Das Ausmaß, in dem Sauerstoff und ROS für Bakterien schädlich sind, hängt normalerweise vom Sauerstoffgehalt in ihrer ökologischen Nische ab. Somit lässt sich eine grobe Unterscheidung zwischen Aerobiern und Anaerobiern treffen, wobei erstere in der Lage sind, antioxidative Enzyme freizusetzen, während letztere diese Fähigkeit nicht besitzen. Sauerstoff ist im Allgemeinen toxisch für Anaerobier, wie zum Beispiel strenge Anaerobier, die maximal 0,5 % Sauerstoff tolerieren können, während moderate obligate Anaerobier 2–8 % Sauerstoff vertragen können20. Andererseits verleiht das Vorhandensein von Antioxidantien und ROS-abfangenden Enzymen den Aerobiern eine Toleranz gegenüber atmosphärischem (21 %) Sauerstoff. Wichtig ist, dass das homöostatische Gleichgewicht zwischen Oxidationsmitteln und Antioxidantien durch eine übermäßige Einwirkung von Sauerstoff und ROS gestört werden kann, was die bakteriellen Abwehrmechanismen überfordert und zum Bakterientod führt21.

Der Zweck der vorliegenden Studie bestand darin, zu untersuchen, ob sauerstoffbasierte Behandlungen Bakterien aus medizinischen Geräten, die CF-Patienten zu Hause verwenden, wirksam beseitigen können, und ihre Wirksamkeit mit der von häufig verwendeten Desinfektionsmitteln wie Ethanol und Wasserstoffperoxid zu vergleichen. Hierzu wurden Gasgemische mit einem Sauerstoffgehalt von mehr als 21 % auf die mögliche Dekontamination von Verneblern zur Behandlung von CF-Patienten untersucht.

Für die vorliegende Machbarkeitsstudie haben wir gut charakterisierte und leicht verfügbare Bakterienstämme verwendet, um Vergleiche zwischen Laboren zu erleichtern. Insbesondere wurden in den Experimenten folgende Stämme verwendet: Escherichia coli ATCC 25.922, Staphylococcus aureus HG-001, Enterococcus faecalis ATCC 29.212, Enterococcus faecalis ATCC 51.299, Klebsiella pneumoniae ATCC 11.228 und P. aeruginosa ATCC 27.853. Jeder Stamm wurde in 20 % Glycerin gelagert und bei –80 °C eingefroren. Ausgehend von den gefrorenen Beständen wurde jeder Stamm auf Blutagarplatten (BA) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C gezüchtet. Am folgenden Tag wurden 5–6 Kolonien ausgewählt, um 20 ml Lysogenie-Brühe (LB; Oxoid) zu inokulieren. 100-ml-Glasflaschen wurden verwendet, um die Bakterien 4 Stunden lang bei 37 °C und unter Schütteln bei 250 U/min zu kultivieren. Es wurden entsprechende Verdünnungen durchgeführt, um ein endgültiges Ausgangsinokulum mit einer gemessenen optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,05 zu erhalten. Bemerkenswert ist, dass wir in den vorliegenden Studien OD600-Messungen als Standard für die Bakterienzelldichte anstelle des alternativen McFarland-Standards verwendet haben22,23.

Die verschiedenen Bakterien wurden wie oben beschrieben gezüchtet. Als Ausgangsinokulum für den Test wurde eine 1 × phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)-Kultursuspension ausgewählt, die 2–4 × 106 koloniebildenden Einheiten (KBE)/ml entspricht. Unter Verwendung von Platten mit 24 Vertiefungen wurden Dreifachansätze, bestehend aus 20 µL Inokulum, auf dem Boden der einzelnen Vertiefungen verteilt. Anschließend ließ man die Platte bei geöffnetem Deckel 1,5 Stunden lang in einem LAF-Schrank (Laminar Air Flow) an der Luft trocknen. Nach dem Trocknen wurde die Platte in einen speziell angefertigten Gasinkubator überführt (Abb. 1). Der Inkubatordeckel wurde auf der Kammer geschlossen und anschließend 5 Minuten lang mit der ausgewählten Sauerstoffmischung bei 0,8 kPa gespült. Anschließend wurde der Gasfluss gestoppt und sowohl der Einlass als auch der Auslass des Inkubators geschlossen. Es wurden Behandlungszeiten von 1, 5, 10 oder 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) verwendet. Nach der Behandlung wurden die Inkubatoren geöffnet und die 24-Well-Platten 20 Stunden bei RT inkubiert. Jede Vertiefung wurde dann 1x mit 600 µL PBS gewaschen, um die Bakterien zu sammeln. Schließlich wurden die verbleibenden lebensfähigen Bakterien durch Reihenverdünnungen, Ausplattieren auf BA und Kolonienzählung quantifiziert, was die Berechnung der jeweiligen KBE/ml ermöglichte.

Versuchsaufbau von Gasinkubationskammern. Ausgehend von (1) wird die Gasflasche an ein Druckventil (2) angeschlossen. Ein Kunststoffschlauch (3) verbindet das Druckventil mit dem Inkubatoreinlass (4). Am Inkubator ist außerdem ein Druckventil vorhanden (5). Im Inkubator (6) wird die experimentelle Agarplatte (7) oder die 24-Well-Mikrotiterplatte (nicht gezeigt) platziert. Sobald der Inkubator mit dem Deckel verschlossen und mit der entsprechenden Gasmischung gespült ist, kann der Gasstrom durch einen Auslass (8) strömen, der sich auf der gegenüberliegenden Seite des Einlasses befindet. An den verschließbaren Auslass (9) ist schließlich ein verstellbarer Schlauch angeschlossen.

Gasinkubatoren, wie in Abb. 1 gezeigt, wurden von den Instrumentenbauern des Universitätsklinikums Groningen (UMCG; „Research Instrumenten-makerij“) hergestellt. Die Inkubatoren hatten eine rechteckige Form mit Abmessungen von 300 mm × 140 mm und einer Höhe von 40 mm. Jeder Inkubator wurde so konzipiert, dass er über einen Einlass und einen Auslass verfügt, um den Gasfluss zu ermöglichen, sowie über ein Sicherheitsdruckventil. Die Inkubatoren bestanden aus zwei separaten Teilen, der Kammer und dem Deckel. Die Kammern wurden mit den Deckeln durch vier Metallklammern an der Seite jeder Kammer verschlossen. Die für die Experimente in der vorliegenden Studie gewählten Sauerstoffkonzentrationen waren: 42 %, 53 %, 63 % und 87 %, wobei der Sauerstoff ausschließlich durch Stickstoff ergänzt wurde. Darüber hinaus wurden Kontrollversuche mit normaler Luft durchgeführt, im Folgenden als 21 % Sauerstoff bezeichnet.

Als repräsentatives Medizinprodukt für den experimentellen sauerstoffvermittelten Desinfektionsprozess wurde der von PARI Pharma vertriebene und von der Westfalen AG gelieferte Ventobra-Vernebler24 ausgewählt. Dieses Gerät ist gemäß den Spaulding-Kriterien „halbkritisch“. Das Ventobra-System wurde kürzlich von der Europäischen Arzneimittelagentur für die Verwendung bei CF-Patienten zugelassen (EMA/169,512/2015 Seite 3/3). In unserer Studie wurde besonderes Augenmerk auf das Tolero®-Handgerät für den Ventobra-Vernebler gelegt, das als Ziel für verschiedene Desinfektionsprotokolle verwendet wird.

Das Tolero-Handgerät wurde in seine drei Einzelteile zerlegt, nämlich eine Kunststoffmembran (MB), ein Mundstück (MP) und ein Metallstück (MT), wie in Abb. 2 dargestellt. Das für das Kontaminationsexperiment ausgewählte Bakterium war P . aeruginosa ATCC 27.853, gezüchtet wie oben beschrieben. Die Oberflächen der drei getrennten Geräteteile wurden absichtlich kontaminiert, indem sie für ~ 10 s mit einer Bakteriensuspension von 2–4 × 106 KBE/ml in PBS (OD600 von 0,05) in Kontakt gebracht wurden. Die drei kontaminierten Geräteteile wurden dann in einem LAF-Schrank an der Luft trocknen gelassen und anschließend zur Behandlung mit einem kontinuierlichen Flussmittel der höchsten getesteten Sauerstoffkonzentration, 87 % O2, für 30 Minuten (0,8 kPa) in Gasinkubatoren gestellt. Nach der Behandlung wurden zwei Ansätze verfolgt, um die Anzahl der Bakterien auf den Oberflächen der Geräteteile zu bestimmen. Der „Stempel“-Ansatz beinhaltete die Kontaktanwendung jedes Zerstäuberteils auf einer BA-Platte. Im Gegensatz dazu umfasste der „Abstrich“-Ansatz das Sammeln von Bakterien von den Oberflächen der Geräteteile mit einem sterilen Wattestäbchen und das anschließende Ausstreichen von BA-Platten. Anschließend wurden die BA-Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert und am nächsten Tag das Bakterienwachstum untersucht.

Das Handgerät des Tolero-Verneblers. Der obere Teil des Bildes zeigt das vollständig zusammengebaute Mobilteil, während der untere Teil des Bildes seine drei Hauptkomponenten im zerlegten Zustand zeigt, nämlich das Mundstück (MP), die Membran (MB) und das Metallteil (MT).

Zur Kontrolle wurden sowohl die Stempel- als auch die Abstrichmethode in zwei unterschiedlichen Ansätzen angewendet. Zunächst wurden die drei absichtlich kontaminierten Geräteteile durch 10-minütiges Eintauchen in 70 % Ethanol oder 30 % Wasserstoffperoxid desinfiziert, 10 Minuten in einem LAF-Schrank luftgetrocknet und auf bakterielle Kontamination getestet. Dadurch konnten wir vor der Wiederverwendung überprüfen, ob die Geräteteile frei von Bakterien waren. Zweitens wurden die Teile, die mit 70 % Ethanol oder 30 % Wasserstoffperoxid desinfiziert wurden, in Wasser getaucht, um sicherzustellen, dass vor der bakteriellen (Re-)Kontamination keine Spuren von Desinfektionsmittel auf den Geräteoberflächen vorhanden waren, die die Ergebnisse unserer Experimente verfälschen könnten steriles MilliQ-Wasser für 10 s.

Die Ergebnisse werden im Mittelwert +/− Standardabweichung dargestellt. Die statistische Analyse der Daten wurde mit GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, USA) durchgeführt, wobei ein p-Wert < 0,05 als signifikant angesehen wurde. Der angewandte Test war ein Zwei-Wege-Anova.

Die Sauerstofftoleranz verschiedener gut charakterisierter Bakterienstämme wurde untersucht, indem sie in Gasinkubatoren 21 % (dh normaler Luft), 43 % oder 53 % Sauerstoff ausgesetzt wurden. Wie in den Abb. dargestellt. Abhängig vom getesteten Bakterienstamm wurden 3, 4 und 5 unterschiedliche Sauerstoffempfindlichkeiten beobachtet. Insbesondere zeigte die KBE-Zählung nach 30-minütiger Inkubation, dass S. aureus HG-001, E. faecalis ATCC 29.212, E. faecalis ATCC 51.299 und E. coli ATCC 25.922 im Allgemeinen weniger empfindlich gegenüber Sauerstoff waren als P. aeruginosa ATCC 27.853 ( Abb. 3). Während die Anzahl lebensfähiger S. aureus HG-001- und E. coli ATCC 25.922-Bakterien bei 53 % Sauerstoff etwa um das Zehnfache reduziert wurde, wurde bei dieser Sauerstoffkonzentration bei den beiden E. faecalis-Stämmen ATCC keine oder höchstens eine zehnfache Reduzierung der lebensfähigen Bakterien beobachtet 29.212 bzw. ATCC 51.299. Im Gegensatz dazu war die Lebendzahl von P. aeruginosa ATCC 27.853 bei Sauerstoffkonzentrationen über 21 % um das 500- bis 100-fache reduziert (Abb. 3), was darauf hindeutet, dass dieses Bakterium am anfälligsten für die Exposition gegenüber molekularem Sauerstoff ist.

Bakterielle Anfälligkeit gegenüber Sauerstoff. Die Empfindlichkeit der Bakterien gegenüber Sauerstoff wird in KBE/ml ausgedrückt. Die Inkubationszeit wurde auf 30 Minuten bei drei verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen eingestellt, nämlich 21 %, 42 % und 53 %. Eine Zwei-Wege-ANOVA ergab statistisch signifikante Unterschiede in der Lebensfähigkeit des Bakterienstamms bei steigenden Sauerstoffkonzentrationen (p-Wert < 0,0001). Bemerkenswert ist, dass wir die scheinbar etwas höhere Sauerstoffempfindlichkeit von P. aeruginosa bei 42 % O2 als bei 53 % O2 auf eine Variation im Aufbau dieser speziellen Versuchsreihe zurückführen, obwohl die Unterschiede in den KBE/ml-Zahlen statistische Signifikanz zeigten .

Zeitabhängigkeit bei der sauerstoffvermittelten Abtötung von (A) S. aureus HG-001 und (B) P. aeruginosa ATCC 27.853. S. aureus HG-001 und P. aeruginosa ATCC 27.853 wurden 1, 5, 10 oder 30 Minuten lang mit 63 % O2 behandelt und auf BA-Agar ausplattiert.

Überleben von P. aeruginosa ATCC 27.853 und S. aureus HG-001 bei Exposition gegenüber 63 % molekularem Sauerstoff, die Kontrollen wurden bei 21 % Sauerstoff inkubiert. Die Empfindlichkeit der Bakterien gegenüber Sauerstoff wird in KBE/ml ausgedrückt. Die Inkubationszeiten wurden auf 1, 5, 10 und 30 Minuten eingestellt. Eine Zwei-Wege-ANOVA ergab statistisch signifikante Unterschiede in der Lebensfähigkeit des Bakterienstamms zu verschiedenen Zeitpunkten (p-Wert < 0,0001).

Um festzustellen, ob ein dreifacher Luftsauerstoffzustand eine wirksamere Eliminierung von S. aureus HG-001 und P. aeruginosa ATCC 27.853 ermöglichen würde, und um die optimale Inkubationszeit zu ermitteln, wurde eine nächste Versuchsreihe durchgeführt. Wie in den Abb. gezeigt. Wie aus den Abbildungen 4 und 5 hervorgeht, nahm die Anzahl lebensfähiger P. aeruginosa ATCC 27.853 bei 63 % Sauerstoff mit der Zeit rasch ab, wobei im Wesentlichen alle Bakterien im Inokulum nach 10-minütiger Inkubation eliminiert wurden. Im Gegensatz dazu zeigte S. aureus HG-001 eine viel höhere Toleranz gegenüber einer Sauerstoffexposition von 63 %, wobei die Anzahl lebensfähiger Tiere nach 30-minütiger Inkubation um etwa das Zehnfache reduziert wurde.

Um die Möglichkeit der Desinfektion von Verneblerhandgeräten mit Sauerstoff zu bewerten, wurde das Tolero-Handgerät eines Ventobra-Verneblers in seine drei Hauptteile zerlegt: die Membran (MB), das Metallteil (MT) und das Mundstück (MP). Diese drei Teile wurden dann einzeln mit P. aeruginosa ATCC 27.853 kontaminiert. Um die mögliche sauerstoffvermittelte Desinfektion zu untersuchen, wurden die drei kontaminierten Teile 30 Minuten lang 87 % Sauerstoff ausgesetzt. Diese Bedingung wurde gewählt, um eine maximale Sauerstoffexposition sicherzustellen. Zur Kontrolle wurden die kontaminierten Teile entweder mit 70 %igem Ethanol oder 30 %igem Wasserstoffperoxid desinfiziert. Nach Sauerstoffeinwirkung oder Desinfektion mit Ethanol oder Wasserstoffperoxid wurden die verschiedenen Teile auf BA-Platten „gestempelt“, die anschließend über Nacht bei 37 °C inkubiert wurden. Abbildung 6 zeigt, dass die Desinfektion mit Ethanol oder Wasserstoffperoxid zur vollständigen Eliminierung der Bakterien führte.

Ethanol- oder Wasserstoffperoxid-vermittelte Desinfektion von Verneblerteilen, die mit P. aeruginosa ATCC 27.853 kontaminiert sind. Die kontaminierten Zerstäuberteile wurden entweder vor oder nach der Desinfektion mit 70 % Ethanol oder 30 % Wasserstoffperoxid (H2O2) auf BA-Platten gestempelt. Anschließend wurden die Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die gelben Pfeile markieren durch Wasserstoffperoxid erzeugte Schaumflecken. MB, Membran; MT, Metallteil; MP, Mundstück.

Abbildung 7 zeigt die Auswirkungen einer 87 %igen sauerstoffvermittelten Desinfektion der mit P. aeruginosa kontaminierten Verneblerteile. Bei 30-minütiger Sauerstoffexposition konnte bei allen drei Teilen eine deutliche Reduzierung der Bakterienbelastung beobachtet werden, besonders deutlich war dies jedoch am kontaminierten Mundstück. Dies wurde sowohl durch Stempeln als auch durch Abtupfen sichtbar gemacht.

Sauerstoffvermittelte Desinfektion von mit P. aeruginosa kontaminierten Zerstäuberteilen ATCC 27.853. Die mit Bakterien kontaminierten Zerstäuberteile wurden entweder vor oder nach 30-minütiger Behandlung mit 87 % Sauerstoff auf BA-Platten gepresst. Alternativ wurden die absichtlich mit Bakterien kontaminierten Teile des Verneblers entweder vor oder nach einer 30-minütigen Behandlung mit 87 % Sauerstoff mit einem Wattestäbchen abgetupft und anschließend die von den Tupferstäbchen resuspendierten Bakterien ausplattiert. Alle Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. MB, Membran; MT, Metallteil; MP, Mundstück.

In der vorliegenden Studie haben wir die Wirksamkeit eines sauerstoffbasierten Desinfektionsansatzes gegen eine Gruppe opportunistischer Krankheitserreger getestet, darunter sowohl gramnegative als auch grampositive Bakterienarten. Die Bakterien waren unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt, die weit über der atmosphärischen Konzentration von 21 % lagen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Anfälligkeit gegenüber Sauerstoff von verschiedenen Faktoren abhängt, wie zum Beispiel der Bakterienart, der Behandlungsdauer und dem Sauerstoffanteil. Interessanterweise zeichnete sich P. aeruginosa unter den getesteten Bakterien dadurch aus, dass es die höchste Sauerstoffempfindlichkeit aufwies. Darüber hinaus zeigen wir, dass man die Sauerstoffempfindlichkeit von P. aeruginosa nutzen kann, um die Belastung medizinischer Geräte zu verringern, wie am Beispiel des tragbaren Verneblers Tolero gezeigt. Dieses Mobilteil wird von Patienten mit Lungenerkrankungen wie CF verwendet und ist daher häufig mit P. aeruginosa kontaminiert. Während unsere vorliegende Studie zeigt, dass herkömmliche Desinfektionsmittel wie Ethanol oder Wasserstoffperoxid bei der Beseitigung hoher Belastungen durch kontaminierende P. aeruginosa wirksamer sind, muss man sich darüber im Klaren sein, dass die hohen bakteriellen Belastungen, die in der vorliegenden Studie auf die Geräteteile ausgeübt werden, dies wahrscheinlich nicht tun durch täglichen Gebrauch erreicht werden. Wichtig ist, dass unsere Beobachtungen zeigen, dass die wirksamste sauerstoffvermittelte Dekontamination für das Mundstück erreicht wird, das während des Gebrauchs der Teil ist, der den Mikroorganismen in der Mundhöhle des Patienten am stärksten ausgesetzt ist.

Während Sauerstoff ein starker Elektronenakzeptor ist, der den Stoffwechsel vieler Organismen in den drei Reichen des Lebens antreibt, ist er auch ein starker toxischer Stoff. Die Atmosphäre unseres Planeten enthält einen Sauerstoffgehalt von bis zu 21 % und sowohl aerobe Mikroorganismen als auch höhere Lebewesen, einschließlich des Menschen, haben gelernt, mit dieser potenziell gefährlichen Umweltbedingung umzugehen. Im Allgemeinen sind Prokaryoten resistenter gegen Sauerstoffkonzentrationen über 40 % als Eukaryoten25,26. Somit können erhöhte Sauerstoffwerte tatsächlich zur Förderung des mikrobiellen Wachstums in Bioreaktoren eingesetzt werden, obwohl eine längere Exposition zu oxidativen Schäden sowohl der produzierenden Mikroorganismen als auch ihrer Produkte führen kann27,28. Bemerkenswerterweise ist jedoch relativ wenig über die absoluten Grenzen der Sauerstofftoleranz verschiedener Bakterienarten bekannt. Insbesondere die Sauerstofftoleranz wurde für anaerobe Bakterien bis zur Grenze der Luftsauerstoffkonzentration von 21 % eingehend untersucht, da höhere Sauerstoffkonzentrationen als unphysiologisch gelten29,30. Aus dem gleichen Grund wurde den Grenzen der Sauerstofftoleranz aerober Bakterien nur sehr wenig Aufmerksamkeit geschenkt, selbst solchen, die Nischen mit schwankenden Sauerstoffspannungen bevorzugen, wie die menschlichen Atemwege. Dies warf die Frage auf, inwieweit diese aeroben Bakterien, einschließlich opportunistischer Krankheitserreger wie P. aeruginosa, mit Sauerstoffkonzentrationen von mehr als 21 % umgehen können. Dementsprechend zielte die vorliegende Studie darauf ab, die potenziell bakterizide Wirkung von Gasgemischen mit einem Sauerstoffgehalt von mehr als 21 % in der Atmosphäre zu untersuchen und zu bewerten, ob solche erhöhten Sauerstoffkonzentrationen zur Desinfektion medizinischer Geräte eingesetzt werden können. Unsere Ergebnisse zeigen, dass P. aeruginosa besonders anfällig für erhöhte Sauerstoffwerte ist. Wir halten diese Beobachtung für relevant, da P. aeruginosa ein berüchtigter Besiedler der Lunge von Patienten mit eingeschränkter Lungenfunktion, einschließlich CF-Patienten, ist, was die Notwendigkeit mit sich bringt, die bakterielle Belastung der von diesen Patienten verwendeten medizinischen Geräte zu minimieren.

Für den Schutz von Patienten mit erhöhter Anfälligkeit für bakterielle Besiedelung und Infektionen sind die fachgerechte Desinfektion und Sterilisation von Medizinprodukten von besonderer Bedeutung. Dementsprechend besteht für Gesundheitsdienstleister und Entwickler medizinischer Geräte ein klarer Bedarf an wirksamen Protokollen, um die Exposition gebrechlicher Patienten gegenüber potenziellen Krankheitserregern auszuschließen oder zumindest zu minimieren. Darüber hinaus können mikrobielle Verunreinigungen die Funktionalität medizinischer Geräte beeinträchtigen. Bakterielle Kontamination ist daher ein ständiges Problem, das die Sicherheit von Geräten gefährdet, insbesondere wenn diese über Oberflächen mit einer relativ hohen Wasseraktivität verfügen, die das mikrobielle Wachstum fördern und in direkten Kontakt mit Patienten kommen31,32. Ein weiterer wichtiger Aspekt im Zusammenhang mit der mikrobiellen Dekontamination ist die Wiederverwendbarkeit teurer Geräte, die andernfalls nach Gebrauch weggeworfen würden. Vernebler gehören zu dieser Kategorie teurer Geräte mit hohem Kolonisierungsrisiko, die wirksame Desinfektionsverfahren erfordern, die zu Hause angewendet werden können. Unsere vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass dies im Prinzip dadurch erreicht werden könnte, dass diese Geräte in einem speziellen Inkubator hohen Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt werden. Ein klarer Mehrwert der sauerstoffvermittelten Desinfektion bestünde darin, dass molekularer Sauerstoff im Gegensatz zu anderen Chemikalien die Wiederverwendbarkeit von Verneblern und anderen medizinischen Geräten nicht beeinträchtigt.

Ein möglicher Mehrwert einer sauerstoffbasierten Behandlung gegen P. aeruginosa würde in der Vorliebe dieses Bakteriums für den Schleim liegen, der sich in der Lunge von CF-Patienten ansammelt. Dieser Schleim ist sauerstoffarm, was die Bakterien dazu zwingen würde, sich stärker auf die anaerobe Atmung zu verlassen33. Interessanterweise wurde von Gupta et al. gezeigt, dass P. aeruginosa unter anoxischen Bedingungen eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika, insbesondere Aminoglykosiden, zeigt34. Diese Beobachtung ist wichtig, da CF-Patienten häufig mit Antibiotika behandelt werden müssen, die mit der Zeit aufgrund erworbener bakterieller antimikrobieller Resistenzen an Wirksamkeit verlieren könnten. Potenziell könnte die Desinfektion von Verneblern mit hohen Sauerstoffkonzentrationen daher dazu beitragen, die Exposition von CF-Patienten gegenüber antimikrobiell resistenten P. aeruginosa zu minimieren.

Zusammenfassend gehen wir davon aus, dass die toxischen Wirkungen von molekularem Sauerstoff zu einem starken Verbündeten im Kampf gegen bakterielle Krankheitserreger werden könnten. Mit dem Vorteil, dass er für den menschlichen Gebrauch unbedenklich ist, stellt Sauerstoff ein Mittel zur Eindämmung des Wachstums bestimmter opportunistischer Krankheitserreger dar, die biotische und abiotische Oberflächen kontaminieren und besiedeln. Dementsprechend könnte es beispielsweise auch bei der Desinfektion von Inkubatoren für Neugeborene nach dem Gebrauch eingesetzt werden, da es sich bei solchen Inkubatoren um teure Geräte handelt, die mit Krankheitserregern kontaminiert werden können, die eine besondere Gefahr für die Gesundheit von Frühgeborenen darstellen32. Dieses Prinzip kann sogar auf nichtmedizinische Anwendungen ausgeweitet werden, einschließlich der Lebensmittelindustrie, wo ein erhöhter Sauerstoffgehalt in Kombination mit einer geringen Wasseraktivität dazu beitragen kann, den Verderb zu verhindern. Die Haupteinschränkung sauerstoffbasierter Desinfektionsansätze liegt jedoch in einer möglicherweise unvollständigen Eliminierung mikrobieller Kontaminanten, wie in unserer vorliegenden Studie dokumentiert. Weitere identifizierte Faktoren, die die Wirksamkeit der sauerstoffbasierten Desinfektion bestimmen, sind die kontaminierenden Bakterienarten, die Dauer der Sauerstoffexposition und die angewendete Sauerstoffkonzentration. Bis eine geeignete Lösung für diese potenziell einschränkenden Faktoren gefunden wird, befürworten wir daher Ansätze, die die Verwendung von hohem Sauerstoffgehalt mit anderen Desinfektionsmitteln wie Ethanol oder Wasserstoffperoxid kombinieren.

Alle im Rahmen der aktuellen Studie generierten und analysierten Daten stehen zur Verfügung.

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Die Autoren danken der Westfalen AG für die Bereitstellung der Gasgemische sowie Anna Borgmann, Hans ten Heggeler und Edo Ebskamp für ihre logistische und technische Unterstützung und hilfreichen Diskussionen.

FMC, AWF und JMvD erhielten Fördermittel aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Fördervereinbarung Nr. 713482 (ALERT-Programm). Diese Studie wurde durch das von INTERREG VA (122084) finanzierte Projekt „health-i-care“ (http://www.health-i-care.eu) unterstützt, das Teil eines niederländisch-deutschen grenzüberschreitenden Netzwerks ist, das von der Europäischen Kommission unterstützt wird. das niederländische Wirtschaftsministerium, das Ministerium für Wirtschaft, Innovation, Digitalisierung und Energie des Bundeslandes Nordrhein-Westfalen, das niedersächsische Ministerium für nationale und europäische Angelegenheiten und regionale Entwicklung sowie die niederländischen Provinzen Drenthe, Flevoland, Fryslân, Gelderland , Groningen, Noord-Brabant und Overijssel.

Abteilung für medizinische Mikrobiologie und Infektionsprävention, Universität Groningen, Universitätsklinikum Groningen, HPC EB80, Hanzeplein 1, 9713, GZ, Groningen, Niederlande

Francis M. Cavallo, Richard Kommers, Alexander W. Friedrich, Corinna Glasner und Jan Maarten van Dijl

Abteilung für Medizinische Mikrobiologie, Universität Groningen, Universitätsklinikum Groningen, Hanzeplein 1, Postfach 30001, 9700, RB, Groningen, Niederlande

Jan Maarten van Dijl

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FMC, AWF, CG und JMvD haben die vorliegende Studie konzipiert; FMC und RK führten die Experimente durch; FMC, RK und JMvD analysierten die Daten; FMC hat das Manuskript verfasst; und FMC, CG und JMvD haben das Manuskript bearbeitet. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Jan Maarten van Dijl.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Cavallo, F., Kommers, R., Friedrich, A. et al. Die Erforschung der sauerstoffvermittelten Desinfektion von Medizinprodukten zeigt eine hohe Empfindlichkeit von Pseudomonas aeruginosa gegenüber erhöhten Sauerstoffwerten. Sci Rep 12, 18243 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23082-3

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Eingegangen: 23. Januar 2022

Angenommen: 25. Oktober 2022

Veröffentlicht: 29. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23082-3

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