Kohlenstoffnanopartikel beeinträchtigen die CFTR-Expression und toxikologisch relevante Signalwege

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 14255 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Mukoviszidose ist eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung, die durch Mutationen im Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR) der Mukoviszidose verursacht wird und zu tödlichem Atemversagen führen kann. Ultrafeine kohlenstoffhaltige Partikel, die in der städtischen Umgebungs- und Innenluft allgegenwärtig sind, gelten zunehmend als Hauptverursacher der globalen Gesundheitsbelastung durch Luftverschmutzung. Ihre Auswirkungen auf die Expression von CFTR und assoziierten Genen in Lungenepithelzellen wurden jedoch noch nicht untersucht. Wir untersuchten daher die Auswirkungen von Kohlenstoffnanopartikeln (CNP), die durch Funkenablation erzeugt werden, auf die menschliche Bronchialepithelzelllinie 16HBE14o− unter Kulturbedingungen der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI). Die ALI-kultivierten Zellen zeigten eine Integrität der Epithelbarriere und eine erhöhte CFTR-Expression. Nach einer 4-stündigen Exposition gegenüber CNP zeigten die Zellen eine verminderte Barriereintegrität sowie eine verminderte Expression von CFTR-Transkripten und Proteinspiegeln. Darüber hinaus ergab die transkriptomische Analyse, dass die CNP-exponierten Zellen Anzeichen von oxidativem Stress, Apoptose und DNA-Schäden aufwiesen. Zusammenfassend beschreibt diese Studie Funken-ablatierte Kohlenstoffnanopartikel in einer realistischen Aerosol-Exposition, um die CFTR-Expression zu verringern, begleitet von transkriptomischen Anzeichen von oxidativem Stress, Apoptose und DNA-Schäden.

Der Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) ist ein wichtiger cAMP-regulierter Chloridkanal in der Zellmembran menschlicher Atemwegszellen. Neben seinem Beitrag zur Schleimhydratation und -obstruktion1 hat CFTR mehrere andere Funktionen und ist für die ordnungsgemäße Lungenphysiologie2 notwendig. CFTR-Mutationen können zur Entwicklung von Mukoviszidose (CF) führen. Interessanterweise weisen CF-Patienten eine phänotypische Variabilität auf, selbst bei Patienten, die dieselbe Mutation tragen3. CF-Phänotypen können durch Umweltfaktoren beeinflusst und unter Luftverschmutzungsbedingungen verstärkt werden4,5.

In städtischen Gebieten besteht die Feinstaubluftverschmutzung überwiegend aus ultrafeinen Kohlenstoffpartikeln, die bei der Verbrennung entstehen6. Abhängig von der emittierenden Quelle können diese mit kontaminierenden Giftstoffen wie Übergangsmetallen und organischen Verbindungen, einschließlich polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe, verbunden sein, die nachweislich zu deren toxischen Wirkungen beitragen7,8,9. Kohlenstoffnanopartikel (CNP) gelten als gutes Modell für den kohlenstoffhaltigen Kern ultrafeiner Umweltpartikel. Studien, die die Auswirkungen von reinem CNP untersuchen, zeigen, dass diese Partikel gesundheitsschädliche Auswirkungen hervorrufen können, die hauptsächlich auf Entzündungsreaktionen bei Nagetieren und Menschen beruhen10,11,12. Die zellulären und molekularen Mechanismen, die entzündungsfördernde und andere gesundheitsschädliche Auswirkungen haben, stehen in engem Zusammenhang mit den reaktiven Sauerstoff erzeugenden Eigenschaften von CNP und der damit verbundenen Entstehung von oxidativem Stress in Lungenzellen und -geweben8,13. Neben DNA-schädigenden Wirkungen können intrazelluläre reaktive Sauerstoffspezies Signalkaskaden auslösen, die zur Produktion und Freisetzung entzündungsfördernder Zytokine und Chemokine führen14,15,16. Während sich ein Konsens über die Bedeutung kohlenstoffhaltiger Nanopartikel bei durch Luftverschmutzung verursachten Lungenerkrankungen wie der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) entwickelt hat, ist ihre spezifische Wirkung auf CFTR und die Pathologie von CF nach unserem besten Wissen noch nicht vollständig geklärt. Eine verringerte CFTR-Expression hat direkte Folgen bei CF-Patienten, es wurde jedoch auch vermutet, dass sie bei Patienten mit COPD2 eine Rolle bei Nicht-CF spielt. Es wurde gezeigt, dass die CFTR-Expression in menschlichen Bronchialepithelzellen durch die Exposition gegenüber Zigarettenrauch verringert wird17,18,19. In-vitro-Studien mit prooxidativen Substanzen legen die Hypothese nahe, dass die Verringerung der CFTR-Proteinspiegel durch oxidativen Stress verursacht werden könnte20. Die Auswirkungen der Exposition von kohlenstoffhaltigen Nanopartikeln gegenüber 16HBE14o− in der Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur (ALI), einschließlich der transkriptomischen Landschaft, der CFTR und der Genexpression des Mukoviszidose-Modifikators, wurden noch nicht vollständig untersucht.

Um diese Frage zu beantworten, untersuchten wir die Auswirkungen von reinem CNP auf die menschliche Bronchialepithelzelllinie 16HBE14o- bei kontrollierter Exposition unter Kulturbedingungen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI). Diese Zellen wurden ausgewählt, weil sie mehrere Merkmale normal differenzierter Bronchialepithelzellen beibehalten, einschließlich eines normalen Karyotyps und der Fähigkeit, eine Epithelbarriere zu bilden21, und unter ALI-Bedingungen kultiviert werden können22,23. Darüber hinaus exprimieren 16HBE14o−-Zellen CFTR an der apikalen Zelloberfläche24, was diese Zelllinie zu einem idealen Modell für CF-bezogene Forschung macht25, auch wenn sie nicht alle Merkmale primärer Epithelzellen rekapitulieren.

Es wurden bereits verschiedene Studien mit 16HBE14o−-Zellen durchgeführt, um die Mechanismen der Toxizität von Feinstaub (PM) und Nanopartikeln in der Lunge zu untersuchen26,27,28. Bemerkenswerterweise haben wir zuvor gezeigt, dass diese Zellen, ähnlich wie Alveolarepithelzellen, auf CNP-Exposition mit entzündungsfördernden Signalereignissen reagieren, die auch in vivo bei exponierten Nagetieren beobachtet wurden29. Dieselabgaspartikel zeigten Auswirkungen auf die Barrierefunktion von 16HBE14o-Zellen, einschließlich einer verringerten Expression von Tricellulin (TRIC), einem verringerten transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER), einer erhöhten Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Dextran-Permeabilität30 und einer veränderten Occludin (OCLN)-Expression31. Eine transkriptomische Analyse von 16HBE14o-Zellen, die PM2,5 in der Luft ausgesetzt waren, ergab eine Hochregulierung von Genen, die am xenobiotischen Stoffwechsel und an Entzündungswegen beteiligt sind, was überwiegend den absorbierten Substanzen wie PAKs zugeschrieben wurde32.

Wie bei den meisten In-vitro-Untersuchungen mit Nanopartikeln wurden die oben genannten Studien in Zellen unter submersen Bedingungen durchgeführt, wobei die Partikel in Suspension verabreicht wurden. Allerdings verändern Wechselwirkungen von Nanopartikeln mit dem Suspensionsmedium die Eigenschaften der Partikel und damit auch die Wirkung auf Zellen33. Um realistischere Partikelexpositionsbedingungen zu erreichen, wurden Ansätze entwickelt, die ALI-Expositionen von Lungenzellmodellen mit Geräten zur Aerosolerzeugung kombinieren27,34,35,36,37.

Daher haben wir in der vorliegenden Studie die 16HBE14o-Zellen in einer automatisierten Expositionsstation35,38,39 unter ALI-Bedingungen exponiert und dabei die kontrollierte Erzeugung von CNP-Aerosolen durch Funkenablation genutzt. Hier berichten wir, dass die CNP-Exposition zu einer verminderten CFTR-Expression führt, begleitet von transkriptomischen Anzeichen von oxidativem Stress, Apoptose und DNA-Schäden.

16HBE14o-Zellen (RRID:CVCL_0112) wurden freundlicherweise von Dr. D. Gruenert (Universität von Kalifornien, San Francisco, CA) zur Verfügung gestellt und in α Minimum Essential Medium (SIGMA, St. Louis, MO, USA), ergänzt mit 10 % fötalem, kultiviert Rinderserum (Thermo Fisher, Waltham, MA USA), 1 % L-Glutamin (Thermo Fisher) und 1 % Penicillin/Streptomycin (Thermo Fisher) bei 37 °C mit 5 % CO2. Kulturflaschen wurden mit einer steril filtrierten Lösung der extrazellulären Matrix (ECM) beschichtet, die menschliches Fibronektin (SIGMA, 10 µg/ml), Rinderserumalbumin (SIGMA, 100 µg/ml) und Kollagen (SIGMA, 30 µg/ml) enthielt. Die Zellen wurden in ECM-beschichteten Kulturflaschen gehalten. Für Experimente wurden 6 × 105 Zellen in unbeschichteten Transwell-Einsätzen (Corning, PET, 24 mm, 0,4 µm Porengröße) mit Kulturmedium ausgesät und 4 Tage lang unter submersen Bedingungen kultiviert. Am Tag 4 nach der Aussaat wurde das apikale Medium in den Einsätzen entfernt und die Zellen wurden 14 Tage lang unter ALI-Bedingungen kultiviert, um die Zelleigenschaften zu charakterisieren. Die CNP-Expositionsexperimente wurden am 5. Tag der ALI-Kultur durchgeführt. Das basolaterale Medium wurde alle zwei Tage ausgetauscht.

Die Entwicklung einer Epithelbarriere wurde anhand von TEER-Messungen beurteilt, die mit einem ERS-2-Volt-Ohm-Meter mit STX01-Stäbchenelektroden (Millipore, Burlington, MA, USA) an jedem Tag der submersen Kultur und an bestimmten Tagen der ALI-Kultur aufgezeichnet wurden. Das Medium wurde in beiden Transwell-Kompartimenten ausgetauscht und die Zellen wurden 25 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und anschließend 2 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten, bevor der TEER gemessen wurde. Für jeden der drei Hohlräume eines Einsatzes wurden Werte aufgezeichnet und der Mittelwert berechnet. Als Hintergrundwert wurden die Werte einer leeren Einfügung ohne Zellen abgezogen.

Die Integrität der Zellbarriere wurde zusätzlich anhand der Durchlässigkeit von 4 kDa FITC-Dextran (SIGMA) bewertet, wie zuvor beschrieben30. Das Medium wurde aus beiden Kompartimenten entfernt, die Zellen und die Vertiefungen mit PBS gewaschen. Basolaterale Vertiefungen wurden mit 1,5 ml DMEM mit hohem Glucosegehalt ohne Phenolrot (Thermo Fisher) gefüllt und 500 µL 5 mg/ml FITC-Dextran (gelöst im gleichen DMEM) wurden in das apikale Kompartiment gegeben. Die Zellen wurden 2,5 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und die Probenfluoreszenz des basolateralen Mediums wurde dreifach in einer schwarzen 96-Well-Platte in einem Tecan Spark-Plattenlesegerät (Tecan, Männedorf, Schweiz) mit Anregung bei 490 nm und Emission bei 520 nm gemessen gegen eine FITC-Dextran-Standardkurve.

Die Färbung von 16HBE14o-Zellen ZO-1 (sc33725, Santa Cruz, CA, USA) unter ALI-Bedingungen wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers unter Verwendung eines Ziegen-IgG-Anti-Ratten-IgG (H + L)-Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher) als Sekundärantikörper durchgeführt , A-11006) und die Hoechst 33.342-Lösung (Thermo Fisher, 62.249). Die Proben wurden mit einem Leica DMi8 Thunder Imager (Leica, Microsystem, Wetzlar, Deutschland) und einem Thunder-Bildverarbeitungssystem abgebildet.

Die CNP wurden durch die Methode der Funkenablation unter Verwendung des VSP-G1-Partikelgenerators (VSParticle, Delft, Niederlande) erzeugt, der mit Graphitelektroden ausgestattet und mit Stickstoff als Trägergas versorgt wurde. Vor den Zellexpositionsstudien wurden verschiedene CNP-Erzeugungsbedingungen für den VSP-G1-Generator verglichen, um die Auswirkungen auf die Eigenschaften der Partikelgrößenverteilung und die Anzahlkonzentrationen zu bewerten, wie in Abb. 1 beschrieben. Die Anzahl der Partikelgrößenverteilung und -konzentration wurde mit einem Scanning Mobility gemessen Partikelgrößenmessgerät (SMPS, Modell 3936, TSI Inc., Shoreview, MN, USA), ausgestattet mit einem Differential Mobility Analyzer (DMA, Modell 3081, TSI Inc.) und einem Kondensationspartikelzähler (CPC, Modell 3776, TSI Inc.). Der DMA wurde mit einer Mantelströmung von 10,5 oder 15 l/min und einer Aerosolströmungsrate von 1,5 l/min betrieben. Die durch die Partikel induzierte Ladung wurde mit einem Elektrometer (Modell 3086B, TSI Inc.) gemessen. Für jede Funkengeneratoreinstellung wurden drei 180 s lange SMPS-Scans aufgezeichnet und der Mittelwert dieser Messungen berechnet.

Physikalische, morphologische und chemische Charakterisierung von durch Funkenablation erzeugten CNPs. (a–f) Normalisierte Partikelanzahlgrößenverteilungen für verschiedene Aerosolgeneratoreinstellungen; Trägergasfluss (2–12 l/min), Lückenspannung 0,7–1,3 kV. (g) Schematische Darstellung des Aufbaus, der für die anfängliche physikalische Charakterisierung funkenablatierter Kohlenstoffnanopartikel verwendet wurde. Der Nanopartikelgenerator VSP-G1 wurde mit Stickstoffträgergas mit einem Durchfluss von 2–12 l/min versorgt. Die erzeugten Partikel wurden am T-Anschluss mit zwei HEPA-Filtern mit Raumluft verdünnt und durch ein Rohrsystem geleitet, um anschließend mit einem Scanning Mobility Particle Sizer, bestehend aus einem elektrostatischen Klassierer mit einem Differential Mobility Analyzer (DMA) und einem Kondensationspartikelzähler, gemessen zu werden (CPC) und ein Elektrometer. Geeignete Strömungsparameter in den Rohren und Geräten wurden durch Vakuumpumpen eingestellt und mit Massendurchflussreglern reguliert. Die Grafik wurde mit dem Grafiktool von Microsoft Power Point erstellt.

Die mittlere Anzahl der Ladungen pro Teilchen (np) wurde gemäß Gl. berechnet. (1)

I = elektrischer Strom (A), e = Elementarladungseinheit, 1,602 × 10–19 Coulomb, N = Partikelanzahlkonzentration (Partikel/cm3), qe = Durchflussrate (cm3/s).

16HBE14o-Zellen-Expositionen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche wurden mit der VITROCELL® Automated Exposure Station (VITROCELL SYSTEMS GMBH, Waldkirch, Deutschland)35,38 durchgeführt. Basierend auf den CNP-Charakterisierungsexperimenten wurde für die ALI-Aufnahmen eine Durchflussrate von 8 l/min Stickstoffträgergas bei 1,0 kV Spaltspannung und 5 mA gewählt. Dementsprechend wurde die erzeugte Testatmosphäre mit gefilterter Raumluft durch einen HEPA-Filter auf einen Durchfluss von 16,6 L/min gemischt und in den auf 37 °C beheizten und zu 85 % befeuchteten Aerosolreaktor der Automated Exposure Station geleitet, woraus ein berechnetes Endergebnis resultierte Sauerstoffkonzentration von ca. 10,9 %. Vom Aerosolreaktor wurden die Partikel durch isokinetische Probenahme mit 100 mL/min zu den Expositionsmodulen mit den Zellen geleitet. Drei Einsätze mit Zellen wurden 4 Stunden lang CNP ausgesetzt, während drei weitere Einsätze befeuchteter und unter Druck stehender sauberer Luft als Kontrollproben (CAC, 21 % O2) ausgesetzt wurden. In einem zusätzlichen Belichtungsmodul wurden die CNP zur Charakterisierung auf Gittern der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (Gitter auf Nickelbasis mit durchgehendem Kohlenstofffilm, 400 Mesh-Größe, Plano GmbH, Deutschland) beprobt, die in einem TEM-Gitterhalter (Vitrocell) immobilisiert waren40. Während der Exposition wurden die Zellen von der basolateralen Seite mit 25 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) ergänztem Kulturmedium versorgt. Die mit diesen Parametern (dh mittlerer Durchmesser von 44 nm, Partikelanzahlkonzentration von 6,36 × 106/cm3) erzeugte abgelagerte Masse des CNP wurde nach 4-stündiger Exposition auf etwa 230 ng CNP geschätzt (Ergänzung 1). Für diese Berechnung haben wir davon ausgegangen, dass sich 1,5 % der aufgetragenen Partikel auf den Zellen ablagern35. Bezogen auf die Oberfläche der Einlage entspricht dies 50 ng/cm2.

Zur morphologischen Bewertung des CNP wurden die erhaltenen TEM-Gitter mittels Rasterelektronenmikroskopie (EM) unter Verwendung eines hochauflösenden Rasterelektronenmikroskops Tescan CLARA RISE (Tescan GmbH, Dortmund, Deutschland) bei einer Beschleunigungsspannung von 15 kV analysiert ein Strom von 100 pA. Typischerweise wurde eine Zoomreihe mit zunehmender Vergrößerung an einer repräsentativen Position des Gitters erhalten. Die Elementzusammensetzung der Partikel wurde durch energiedispersive Röntgenanalyse (EDAX Octane Elect-Detektor, AMETEK GmbH, Wiesbaden, Deutschland) analysiert und die Reinheit des erzeugten CNP bestätigt.

Nach der Messung der TEER- und FITC-Dextran-Permeabilität nach der Exposition wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und in TRIzol zur RNA-Isolierung unter Verwendung des säulenbasierten Direct-zol-RNA-Präparationskits (Zymo Research, Freiburg, Deutschland) homogenisiert. Für die cDNA-Synthese wurden 500 ng Gesamt-RNA mit dem High-Capacity RNA-to-cDNA Kit (Thermo Fisher) verwendet. Die Genexpression wurde mit KAPA SybrFast qPCR Mastermix (SIGMA) auf einem QuantStudio 3-Gerät (Thermo Fisher) mit Oligonukleotiden für verschiedene Zielgene gemessen (Ergänzung 2). PGK1 wurde als Referenzgen verwendet und die Expression wurde mit der ΔΔCt-Methode41 berechnet.

Das Gesamtprotein wurde mit 1 × RIPA-Lysepuffer (Cell Signaling Technologies CST, Danvers, MA, USA) extrahiert, der Protease- und Phosphataseinhibitoren (Roche, Basel, Schweiz) enthielt. Die Proteinkonzentration des geklärten Lysats wurde mit dem Pierce BCA-Assay (Thermo Fisher) gemessen. Dreißig µg Gesamtprotein (4X LDS-Puffer) wurden 5 Minuten lang bei 90 °C denaturiert und auf einem 4–12 %igen Bis-Tris-Gel unter denaturierenden Bedingungen mit MOPS-Puffer aufgetrennt und 30 Minuten lang mittels halbtrockenem Turbo Blotting auf eine PVDF-Membran übertragen Mindest. Zwei verschiedene Membranen wurden mit 5 % BSA/TBS-T blockiert und jeweils mit Primärantikörpern gegen CFTR (Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-376683, RRID:AB_11151574, 1:500) und Beta-Actin (Cell Signaling Technology Cat# 3700) inkubiert , RRID:AB_2242334, 1:1000) über Nacht bei 4 °C in 5 % BSA/TBS-T. Sekundär-HRP-konjugierter Anti-Maus-Antikörper (Cell Signaling Technology Cat# 7076, RRID:AB_330924, 1:2000) wurde 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und Banden wurden mit Western Bright Chemilumineszenzsubstrat (Advansta Inc., San Jose, CA) nachgewiesen , USA) auf einem LICOR-Gerät. Die Bandenintensitäten wurden mit der Image Studio Lite-Software (Image Studio Lite, RRID:SCR_013715) analysiert. Um die CFTR-Antikörperspezifität zu testen, wurden 16HBE14o-Zellen mit CFTR-siRNA (Ambion Silencer, s534180) unter Verwendung von Lipefectamin 2000 (Thermo) oder Nucleofection (Amaxa, Lonza) gemäß dem Protokoll und der Proteinexpression des Herstellers transfiziert. 3 Tage nach der Transfektion wurde die CFTR-Expression mittels WB-Analyse analysiert (Daten nicht gezeigt). Original-WB-Zahlen (Ergänzung 8) und Metriken können unter https://tinyurl.com/2mtjuc9w heruntergeladen werden.

RNAseq-Experimente wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt42. Kurz gesagt, die Qualität der isolierten RNA wurde mit dem High Sensitivity RNA Screen Tape System (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) bestimmt. Alle Proben zeigten einen RIN-Wert > 7,7. Die Bibliotheksvorbereitung, einschließlich reverser Transkription und Multiplexierung der Proben, wurde mit dem PCR cDNA Barcoding Kit (Oxford Nanopore Technologies, Oxford, Vereinigtes Königreich) unter Verwendung von 50 ng Gesamt-RNA durchgeführt. Die Menge der amplifizierten cDNA wurde mit dem Qubit 4 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemessen und die Fragmentgröße wurde mit dem Agilent D1000 ScreenTape-Assay (Agilent Technologies) untersucht. Die SpotON-Durchflusszelle (R9.4.1, FLO-MIN106D) wurde mit dem Flow Cell Priming Kit (EXP FLP002, Oxford Nanopore Technologies) vorbereitet und gleiche Mengen barcodierter cDNA wurden auf insgesamt ~ 100 fmol geladen. Die Sequenzierung wurde mit einem MinION-Gerät (MN33710) unter Verwendung der MinKNOW-Software (v.21.02.1) über einen Zeitraum von 72 Stunden durchgeführt.

Rohe Fast5-Lesevorgänge von Oxford Nanopore (ONT) wurden vom Guppy GPU Basecaller (Version 5.0.11 + 2b6dbffa5) mit dem hochpräzisen Modell dna_r9.4.1_450bps_sup.cfg in Fastq-Dateien konvertiert. Wir verwendeten ein Standard-Qualitätskontrollsystem ONT MinIONQC43 und ein Allzweck-FastQC, um die Lesequalität zu untersuchen und Anomalien im Basisqualitätswert, GC-Inhalt, Sequenzduplikationsniveau, Adapterinhalt und Leselänge zu erkennen.

Die Sequenzablesungen wurden mithilfe von Minimap244 und Samtools45 an das Genome Reference Consortium GRCh38 angepasst, um BAM-Dateien mit optimierten Parametern für Nanopore zu erstellen. Feature Counts/Rsubread46 wurde verwendet, um die Genanzahlmatrizen zu berechnen. Anschließend werden ausgerichtete Lesevorgänge mithilfe des Ensembl 102-Datensatzes Referenztranskripten zugeordnet. Wir haben auch HTSeq47 verwendet, um sicherzustellen, dass durch gegenseitige Genzählungsmatrizen aus zwei Methoden keine abnormale Zuordnung zur Genomannotation erfolgt. Zur Analyse der differentiellen Expression verwenden wir DESeq2 und Duesselpore48,49, was die zuverlässige Fähigkeit zur Verarbeitung von RNA-Seq in einer kleinen Anzahl von Replikaten zeigt.

Alle Expositionsexperimente wurden mit drei biologischen Replikaten durchgeführt und wiederholt, und alle Analysen verwendeten mindestens zwei technische Replikate. Genaue Bedingungen und statistische Tests sind in den Abbildungslegenden dargestellt. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Grafiken erstellt und die statistische Signifikanz mit der Software GraphPad Prism 8 (GraphPad Prism, RRID:SCR_002798) berechnet. Die experimentelle Zeitmessung wurde mit einem Omega Speedmaster Professional Kaliber 1863 durchgeführt.

CNPs wurden unter Verwendung verschiedener Parameterkombinationen erzeugt, z. B. Trägergasfluss (N2) und Spaltspannung. Alle Partikelgrößenverteilungen waren logarithmisch normal und lagen im Bereich zwischen 5 und 300 nm (Abb. 1a – f). Verschiedene Parameterkombinationen aus Trägergasfluss und Spaltspannung wurden verwendet, um die gewünschten CNP-Größeneigenschaften für die ALI-Expositionsexperimente festzulegen. Der Messaufbau (Abb. 1g) repräsentierte daher die Bedingungen (Gesamtdurchfluss, Rohrlängen und Rohrdurchmesser), die unter den Belichtungsbedingungen in der automatischen Belichtungsstation herrschen.

Die Barriereintegrität von Zellen unter ALI-Bedingungen (Abb. 2a) wurde durch Messung von TEER (Abb. 2b, Ergänzung 3a), FITC-Dextran-Permeabilität (Ergänzung 3b) und mRNA-Expression von Markern für Tight Junctions, Adherens Junctions und CFTR (Ergänzung) bewertet 3c). Die TEER-Werte waren denen ähnlich, die zuvor für 16HBE14o-Zellen beobachtet wurden (Ergänzung 3a, b)38,39. Zur Quantifizierung der transepithelialen Permeabilität wurde ein FITC-Dextran-Permeabilitätstest durchgeführt. Bis zum dritten Tag der ALI-Kultur betrug die FITC-Dextran-Permeabilität ca. 0,55 mg/mL, entsprechend ca. 72 % der zellfreien Permeabilität weisen darauf hin, dass zwischen den Zellen keine dichte Barriere besteht. Die Durchlässigkeit sank am Tag 6 auf ca. 0,25 mg/ml, entsprechend 25 % der zellfreien Permeabilität, und blieb bis zum 14. Tag der ALI-Kultur bei etwa 0,3 mg/ml (Ergänzung 3b). Wir untersuchten die mRNA-Expression von Markern für Zell-Zell-Kontakt und CFTR (Beilage 3c). Die CLDN1-Expression stieg stetig auf ca. vervierfachen sich am 6. Tag und ca. 11-fach am Tag 14 im Vergleich zum Tag 0. Die Expression des Adherens-Junction-Gens CDH1 (E-Cadherin) stieg stetig auf ca. nach 14 Tagen ALI-Kultur verdoppelt. Die CFTR-Expression nahm auch während der ALI-Kultur zwischen Tag 6 und Tag 14 zu (Ergänzung 3c). Darüber hinaus scheinen 16HBE14o-Zellen Polarität aufzuweisen, wie durch ZO-1 und Kernfärbung nahegelegt (Ergänzung 3d). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die 16HBE14o-Zellen unter ALI-Bedingungen in der Lage sind, eine geeignete morphologische und funktionelle Barriere für Modellatemwege unter physiologischen Bedingungen und als Reaktion auf Belastungen wie Giftstoffe und Krankheitserreger zu bilden.

Bewertung der Barriereintegrität in ALI-kultivierten 16HBE14o-Zellen vor und nach der Exposition. (a) Schematische Darstellung von ALI-kultivierten 16HBE14o-Zellen (b) Dargestellt ist die schematische Darstellung eines TEER-Geräts (c, d) TEER wurde wie im Methodenabschnitt beschrieben vor und nach dem ALI-Start bis zum 5. Tag (Vorbelichtung) gemessen. und relativ zu den TEER-Werten am Tag -3 ausgedrückt. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM von vier unabhängigen Experimenten mit drei Transwell-Einsätzen für jedes Experiment. Jeder Transwell-Einsatz wurde an drei Hohlräumen gemessen und der Mittelwert aufgezeichnet. Der TEER-Wert wurde direkt vor (vor der Exposition) und nach (nach der Exposition) 4-stündiger CNP- oder CAC-Exposition gemessen und im Verhältnis zu den TEER-Werten am Tag -3 ausgedrückt. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM von zwei oder drei unabhängigen Experimenten mit drei Transwell-Einsätzen für jedes Experiment. (e) Die FITC-Dextran-Permeabilität wurde einen Tag vor (vor der Exposition) und direkt nach (nach der Exposition) CNP- oder CAC-Exposition gemessen. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM von drei unabhängigen Experimenten mit drei Transwell-Einsätzen für jedes Experiment. Zweiseitiger, ungepaarter Student-T-Test; *p < 0,05; **p < 0,01.

Um die Auswirkungen von CNP auf die Integrität der Epithelbarriere zu bewerten, haben wir TEER während der Kultur der Zellen direkt vor und nach einem 4-stündigen Expositionsintervall gemessen. Die TEER-Entwicklung zwischen verschiedenen Transwell war nicht unterschiedlich, wenn man sie auf den Startwert am Tag –3 bezog (Abb. 2c). Die TEER-Werte waren in beiden Gruppen vor der CNP-Exposition ähnlich und dies wird besonders deutlich, wenn man die TEER-Werte der CNP-exponierten Zellen als CAC-Falte ausdrückt, die nach der Exposition deutlich niedriger ist als vor der Exposition (Abb. 2d). Wir haben auch die FITC-Dextran-Permeabilität in den CNP-exponierten Zellen gemessen. Die Werte für die Vorexposition wurden einen Tag vor der Exposition gemessen, während die Werte für die Nachexposition nach der TEER-Messung direkt nach der 4-stündigen Exposition gemessen wurden. CNP-exponierte Zellen wiesen nach der Exposition eine signifikant höhere FITC-Dextran-Permeabilität auf als vor der Exposition (Abb. 2e). Diese Daten weisen auf eine verminderte Barriereintegrität in CNP-exponierten Zellen hin.

Um die CFTR-Genexpression in CAC- und CNP-exponierten Zellen zu beurteilen, wurden Echtzeit-qPCR-Experimente durchgeführt (Abb. 3a). Die CFTR-mRNA-Expression war in CNP-exponierten Zellen im Vergleich zu sauberer Luft deutlich um etwa 40 % herunterreguliert (Abb. 3a). Interessanterweise fanden wir auch zwei Mukoviszidose-Modifikatorgene, ANO1 (TMEM16A) und TNFAIP3, die in CNP-exponierten Zellen um 60 % bzw. 70 % herunterreguliert waren (Abb. 3b). Eine verringerte Expression von CFTR war auch auf Proteinebene erkennbar (Abb. 3c), obwohl weitere Experimente erforderlich sind, um den zugrunde liegenden Mechanismus zu bestimmen. Die Wechselwirkung von Lungenzellen mit CNP wurde mit der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies in Verbindung gebracht, die zu intrazellulärem oxidativem Stress führen13. Darüber hinaus deuteten Studien von Cantin et al. auf einen Zusammenhang zwischen Prooxidantien und dem Verlust von CFTR20 hin. Wir führten daher Echtzeit-qPCR-Experimente durch, die auf Gene abzielten, die an pro- und antioxidativen Zellreaktionen in Zellen nach Exposition gegenüber CNP beteiligt sind (Abb. 3d). Die HMOX1-Expression wurde drastisch um ca. erhöht. 80-fach in CNP-exponierten Zellen. Ebenso war die Expression von NFE2L2 als Transkriptionsfaktor für die Regulierung des Redoxgleichgewichts und schützender antioxidativer Reaktionen (einschließlich HMOX1-Induktion) signifikant erhöht. Im Gegensatz dazu war die Katalase-Genexpression (CAT) deutlich herunterreguliert, während die SOD1-, SOD2- und GPX1-Expression unverändert blieb. Bemerkenswert ist, dass die Exposition gegenüber dem Stickstoff-Luft-Gemisch allein weder die Barriereintegrität noch die Genexpression beeinflusste, was darauf hindeutet, dass die beobachteten Effekte partikelbedingt sind (Ergänzung 4).

Analyse der Expression von CFTR- und oxidativem Stress-bedingten Genen (a) Schematische Darstellung eines qPCR-Geräts und einer für die Analyse verwendeten Platte. (b) ALI-kultivierte 16HBE14o-Zellen wurden funkenablatiertem CNP ausgesetzt, das mit einem Stickstoffgasfluss von 8 l/min, einer Lückenspannung von 1,0 kV und 5 mA am 5. Tag der ALI erzeugt wurde, und die Genexpression von CFTR, ANO1 und TNFAIP3 wurde gemessen qPCR, normalisiert auf PGK1-Expression. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM von drei unabhängigen Experimenten. Jedes Experiment wurde mit zwei technischen Replikaten gemessen. Zweiseitiger, ungepaarter Student-T-Test, * p < 0,05, ** p < 0,01. (c) Aus den gleichen Zellen wurden Proteine isoliert und 30 µg Protein einer Western-Blot-Analyse (beschnittenes Bild, dargestellt sind die Spuren 4 und 5 von Abb. S9 mit dem vollständigen Western-Blot-Bild mit 3 biologischen Replikaten) auf CFTR und β- Aktin als Referenzprotein. Die Daten werden als Faltung der CAC-Proben ausgedrückt. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM von vier unabhängigen Experimenten. Zweiseitiger, ungepaarter Student-T-Test, **p < 0,01. (d) Eine Reihe von Markern für oxidativen Stress wurde mittels qPCR analysiert. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM von drei unabhängigen Experimenten. Jedes Experiment wurde mit zwei technischen Replikaten gemessen. Zweiseitiger, ungepaarter Student-T-Test, * p < 0,05.

Oxford Nanopore Sequencing (Abb. 4a) wurde verwendet, um die transkriptomische Landschaft von 16HBE14o-Zellen nach CNP-Exposition zu analysieren. Die Heatmap-Analyse von RNA-Seq-Daten identifizierte mehrere unterschiedlich exprimierte Gene (Abb. 4b). Die CFTR- und TNFAIP3-Expression wurde in vergleichbarem Ausmaß wie bei qPCR herunterreguliert (Abb. 4c), während keine ANO1-Expression nachgewiesen wurde. Darüber hinaus zeigte das Expressionsmuster für oxidative Stressmarker leicht unterschiedliche Ergebnisse als die qPCR-Messung (Abb. 4d). Im RNA-Seq-Datensatz wurde NFE2L2 in verschiedenen Proben nicht unterschiedlich exprimiert. Im Gegensatz dazu war die SOD2-Expression deutlich herunterreguliert, während die SOD1-Expression deutlich hochreguliert war. Die CAT-Expression war deutlich herunterreguliert und in CNP-exponierten Zellen kaum nachweisbar.

RNA-Seq-Analyse von 16HBE14o-Zellen, die Reinluftkontrolle oder funkenablatiertem CNP ausgesetzt waren. (a) Die RNA-Seq-Analyse wurde mit einem minION-Gerät (ONT, oben) durchgeführt. DNA- oder RNA-Moleküle passieren eine Pore und verursachen beim Durchgang durch die Pore Veränderungen im elektrischen Signal (unten). Schließlich werden diese Signalschwankungen mit speziellen Algorithmen (b) Heatmap-Analyse von RNA-Seq-Daten weiter in verschiedene Basen übersetzt (Basen genannt). Visualisiert werden die 30 am häufigsten differenziell exprimierten Gene in einem Heatmap-Diagramm und die Gene, die nach dem p-Wert des Wald-Tests geordnet und dann nach hierarchischer Clusterung (c) CFTR- und TNFAIP3-Expression oder (d) Markern für oxidativen Stress gruppiert werden. Die Daten werden als Faktor der Reinluftkontrolle (CAC) ausgedrückt. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM von zwei (CNP) oder drei (CAC) unabhängigen Experimenten. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des DESeq2-Algorithmus berechnet, wie im Abschnitt „Methode“ beschrieben. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.

Eine Herunterregulierung der CFTR und die Induktion von oxidativem Stress bei CNP-Exposition können möglicherweise die Expression anderer Gene beeinflussen. Daher konzentrierten wir uns bei der Durchführung der RNA-Seq-Datenanalyse auf unterschiedlich exprimierte Gene, die zu Apoptose, DNA-Schäden, Zellstress und Entzündungswegen gehören. Eine stark erhöhte Expression von ATF3, ATF4, PMAIP1, CDKN1A, DDIT3 und DDIT4 deutete auf einen aktivierten Apoptoseweg und eine DNA-Schädigung in CNP-exponierten Zellen hin (Abb. 5a). Dies wurde durch eine deutlich verminderte Expression verschiedener Histon-1-Untereinheiten gestützt (Abb. 5b). Eine stark erhöhte Expression verschiedener Hitzeschockprotein-Gene und DNA-bindender Protein-Gene in CNP-exponierten Zellen lässt darauf schließen, dass sie sich in einem Stresszustand befinden (Abb. 5c). Wir haben auch Marker für den Entzündungsweg gemessen und zeigen deutlich unterschiedlich regulierte Gene (Abb. 5d). TNF, IKBKE, CXCL1 und IL1B waren in CNP-exponierten Zellen herunterreguliert, während GDF15 stark hochreguliert war.

Durch RNA-Seq analysierte differenziell regulierte Gene zeigen weitere nachteilige Auswirkungen von CNP auf 16HBE14o-Zellen. Isolierte RNA wurde einer Long-Read-Nanoporensequenzierung unterzogen, um die Genexpression verschiedener Marker zu analysieren, die an Apoptose und DNA-Schäden (a,b), Hitzeschock und DNA-Bindung (c) oder entzündlichen Prozessen (d) beteiligt sind. Die Daten werden als CAC-Falte ausgedrückt . Die Daten sind Mittelwerte ± SEM von zwei (CNP) oder drei (CAC) unabhängigen Experimenten. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des DESeq2-Algorithmus berechnet, wie im Abschnitt „Methode“ beschrieben. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.

Kohlenstoffnanopartikel machen einen erheblichen Anteil der Feinstaubpartikel in städtischen Umgebungen aus und es ist heutzutage allgemein bekannt, dass sie schädliche Auswirkungen auf Lungenzellen haben14,50,51. Das Einatmen von Feinstaub als Hauptbestandteil der Luftverschmutzung im Freien beeinträchtigt die menschliche Gesundheit und verschlimmert die Symptome bei Patienten mit chronischen Atemwegserkrankungen wie CF52,53. CF-Patienten mit mutiertem CFTR zeigen sehr variable Phänotypen, selbst bei Patienten mit derselben Mutation3, was darauf hindeutet, dass Umweltfaktoren die Schwere der Erkrankung beeinflussen können. Die CFTR-Expression ist für die Lungenfunktion von grundlegender Bedeutung, ihre Expression nach CNP-Exposition in menschlichen Lungenzellen wurde jedoch bisher nicht untersucht. Daher wollten wir hier testen, ob CNP die CFTR-Expression beeinflusst und ob die Umgebung diese Diskrepanzen erklären kann. Daher haben wir zunächst ein ALI-System mit Zellen etabliert, die in der CF-Forschung und in toxikologischen Studien umfassend eingesetzt wurden. Durch die Kultivierung von 16HBE14o-Zellen am ALI zeigten wir eine sich entwickelnde Barriereintegrität, die durch eine verringerte FITC-Dextran-Permeabilität angezeigt wird. Dies wird durch die erhöhte CLDN1-Genexpression während der ALI-Kultur der Zellen gestützt, was darauf hindeutet, dass dieses Protein einen wesentlichen Beitrag zu dieser Barriere leistet. Darüber hinaus deutet der Anstieg der CFTR-Expression während der ALI-Kultur darauf hin, dass sich eine Zellpolarität entwickelt, da CFTR überwiegend in die apikale Zellmembran eingebaut wird. Die Bildung einer Zellpolarität wurde auch durch ZO-1-Immunfärbung (Ergänzung 3d) nahegelegt, wie zuvor auch von He et al.39 gezeigt.

Mit dem Partikelgenerator VSP-G1 erzeugten wir reines CNP mit einem mittleren Durchmesser von ca. 44 nm und einer Partikelanzahlkonzentration von 6,36 × 106/cm3. Mit diesen Parametern berechneten wir die auf den Zellen abgelagerte Partikelmasse nach 4-stündiger Exposition auf ca. 50 ng/cm2. Diese Berechnung basierte auf dem mittleren Partikeldurchmesser und nicht auf der Anzahl der Partikelgrößenverteilungen. Aufgrund des Vorhandenseins von Agglomeraten ist die effektive Dichte der Kohlenstoffpartikel jedoch geringer als ihre physikalische Dichte54. Die Annahme einer geringeren Dichte würde zu einer noch geringeren Partikelmasse führen, als mit unserer Berechnung bereits geschätzt. Die Größenverteilung der Partikel wurde zudem elektronenmikroskopisch untersucht und die Elementanalyse bestätigte deren chemische Reinheit. Silizium und Sauerstoff im Partikel, gemessen durch EDS, könnten von Siloxanen stammen, die aus dem Silikonschlauch entgasen, der den Partikelgenerator mit der Belichtungsstation verbindet55.

Die Exposition von 16HBE14o-Zellen gegenüber CNP führt zu einem verringerten TEER und einer erhöhten FITC-Dextran-Permeabilität, was darauf hindeutet, dass CNP die Barriereintegrität in ALI-kultivierten 16HBE14o-Zellen verringert (Abb. 2d, e). Dieselmotorabgaspartikel zeigten in früheren Studien trotz Unterschieden in der Partikelzusammensetzung sowie der Zellkultur und den Expositionsbedingungen ähnliche Reaktionen30,31.

Um unsere ursprüngliche Hypothese zu untersuchen, dass inhalierte kohlenstoffhaltige Partikel einen Einfluss auf die CFTR-Häufigkeit haben könnten, haben wir die Fähigkeit von CNP getestet, die CFTR-Genexpression zu verändern. Wir stellten eine signifikante Herunterregulierung der CFTR-Expression auf Protein- und Transkriptebene nach einer 4-stündigen Exposition gegenüber CNP in den ALI-kultivierten 16HBE14o-Zellen fest. Unseres Wissens sind wir die erste Gruppe, die über solche Effekte durch CNP berichtet.

In unseren Einstellungen wurde ein solcher Effekt bei Zellen, die dem Stickstoff-Luft-Gemisch ohne Partikel ausgesetzt waren, nicht beobachtet (Ergänzung 4). Dies weist darauf hin, dass niedrigere Sauerstoffwerte im AES (10,9 % gegenüber 21 %) per se keine veränderten CFTR- und oxidativen Stressreaktionen in den 16HBE14o-Zellen hervorrufen, obwohl ein gewisser vorbereitender oder additiver Effekt auf die beobachteten CNP-Effekte nicht vollständig ausgeschlossen werden kann . Eine Herunterregulierung von CFTR fördert den Übergang vom Epithel zum Mesenchym (EMT) bei der Entstehung von Brustkrebs56. Während der EMT verlieren Epithelzellen ihre polarisierte Funktionalität und ihren Zell-Zell-Kontakt57. CFTR wird auf der apikalen Oberfläche der Zellen exprimiert58. Daher könnte der Verlust der Zellpolarität durch EMT mit einer verminderten CFTR-Expression verbunden sein. EMT wurde auch mit einer verminderten Expression der Mikro-RNAs MIR205 und MIR12659,60 in Verbindung gebracht. Interessanterweise wurde auch berichtet, dass MIR126 in CF-Atemwegsepithelzellen herunterreguliert ist61. In unserer RNA-Seq-Analyse (Ergänzung 5, 6, 7) von CNP-exponierten Zellen war die MIR205HG-Expression herunterreguliert (Abb. 4b, Ergänzung 5), und obwohl MIR126 nicht nachgewiesen wurde, war die Expression eines seiner Hauptziele, VEGFA, hoch erhöht (Abb. 4b, Beilage 5). Bemerkenswert ist, dass eine verringerte Expression und Funktion von CFTR zuvor mit einer erhöhten VEGF-A-Expression im Atemwegsepithel in Verbindung gebracht wurde62. Zusammen mit einer verringerten Barriereintegrität und einer herunterregulierten CFTR-Expression könnten diese Daten auf erste Anzeichen einer EMT in CNP-exponierten Zellen hinweisen.

Die molekularen Mechanismen, die die CFTR-Herunterregulierung auf Transkript- und Proteinebene bei CNP-Exposition steuern, müssen weiter untersucht werden.

Auf Proteinebene besteht die Möglichkeit, dass die Exposition gegenüber Kohlenstoffpartikeln zur CFTR-Internalisierung und zum CFTR-Abbau führt. Tatsächlich wurde kürzlich gezeigt, dass die Exposition gegenüber Zigarettenrauch einen retrograden Transport von CFTR zum endoplasmatischen Retikulum in einer von Clathrin/Dynamin abhängigen Weise induziert63.

Darüber hinaus zeigten CNP-exponierte Zellen eine erhöhte Expression von Genen, die an der Regulierung von oxidativem Stress beteiligt sind, und es wurde gezeigt, dass oxidativer Stress zu einer Herunterregulierung der CFTR in T84- und Calu-3-Zellen führt20.

Wir zeigten eine signifikante Herunterregulierung von ANO1 und TNFAIP3 in CNP-exponierten Zellen. ANO1 kodiert einen Transmembrankanal, der für die Schleimsekretion und -produktion von entscheidender Bedeutung ist. Es wird angenommen, dass er mit CFTR zusammenwirkt und den CFTR-Mangel teilweise ausgleichen kann64,64,66. Bei CF-Patienten wurde über eine verminderte TNFAIP3- und CFTR-Expression berichtet und scheint klinisch mit der Lungenfunktion zu korrelieren67. Darüber hinaus war TNFAIP3 bei städtischen Asthmapatienten herunterreguliert68, was auf eine wichtige Rolle von TNFAIP3 (A20) bei Atemwegserkrankungen hinweist. A20 ist ein negativer Regulator der NFκ-B-Aktivierung mit entzündungshemmenden Eigenschaften69. Eine verminderte Expression von TNFAIP3 lässt daher auf eine proinflammatorische Reaktion in CNP-exponierten Zellen schließen. Dies wurde jedoch in unserer Transkriptomanalyse nicht dargestellt, in der die meisten unterschiedlich regulierten Gene herunterreguliert wurden, mit Ausnahme von GDF15, bei dem es sich Berichten zufolge um ein stressinduziertes Zytokin handelt70. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Herunterregulierung von ANO1 und TNFAIP3 zusammen mit der verringerten CFTR-Expression in CNP-exponierten 16HBE14o-Zellen auf einen ungesunden Zustand der Lungenzellen schließen lässt.

Unter anderem waren HMOX1 und NFE2L2 signifikant erhöht, während CAT signifikant verringert war. Dieses Ausdrucksmuster wurde bereits in Zuständen oxidativen Stresses gezeigt, selbst wenn man Zigarettenrauch oder Schwebeteilchen ausgesetzt war71,71,73. In diesem Szenario reichert sich einerseits Wasserstoffperoxid aufgrund der verminderten CAT-Expression in der Zelle an. Andererseits führt hochreguliertes HMOX1 zu einer erhöhten Produktion von Fe2+-Ionen, die wiederum die Fenton-Reaktion von Wasserstoffperoxid zu Hydroxylradikalen unterstützen. Dies induziert eine negative Spirale, die den oxidativen Stress in der Zelle verschlimmert und zu DNA- und Zellschäden sowie Apoptose führt74,75.

Unsere RNA-Seq-Analyse zeigte eine deutliche Hochregulierung mehrerer Gene, die mit einem apoptotischen Zustand oder der Signatur einer DNA-Schädigung verbunden sind. Apoptose wurde bei CF76,76,78 und in Bronchialepithelzellen beobachtet, die Kohlenstoffnanopartikeln ausgesetzt waren51,79. DNA-Schäden und -Wege, die die entfaltete Proteinreaktion und den Stress des endoplasmatischen Retikulums (ER) involvieren, wurden auch in CNP-exponierten Zellen induziert und bei wenigen CF-Patienten beobachtet80,81. Darüber hinaus wurden Histon-Untereinheiten deutlich herunterreguliert, während CDKN1A hochreguliert wurde, was bei DNA-Schäden beschrieben wurde82.

Ergänzend zu unseren aktuellen Erkenntnissen haben ALI-Expositionsstudien mit nicht-zystischer Fibrose (CF) und CF-Atemwegsepithelzellen deutliche weitere Unterschiede in der Anfälligkeit gegenüber Nanopartikeln ergeben. Mithilfe von FITC-markierten Modellnanopartikeln konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme und interzelluläre Akkumulation dieser Partikel in CF-Zellen im Vergleich zu Nicht-CF-Epithelzellen verstärkt ist83. Eine Rolle von CFTR bei diesen Aufnahmeunterschieden wurde durch Antisense-Oligonukleotid-basierte Herunterregulierung in NP-exponierten Epithelzellen bestätigt. In einer anderen Studie wurden die Wirkungen von durch Funken erzeugtem CNP sowie von Silbernanopartikeln bei CF mit normalen Bronchialepithelien unter ALI-Bedingungen verglichen. In den CF-Zellen wurden eine verstärkte Nekrose sowie eine erhöhte Caspase-3-Aktivität und IL-6-Freisetzung beobachtet36. Zusammenfassend deuten unsere transkriptomischen Daten darauf hin, dass CNP-exponierte Zellen oxidativen Stress, DNA-Schäden und einen apoptotischen Zustand aufweisen. Somit eignen sich ALI-kultivierte 16HBE14o-Zellen für eine toxikologische Bewertung funkenablatierter Nanopartikel nach Aerosolexposition.

Zusammenfassend beschreibt diese Studie Funken-ablatierte Kohlenstoff-Nanopartikel in einer realistischen Aerosol-Exposition, um die CFTR-Expression zu verringern, begleitet von transkriptomischen Anzeichen von oxidativem Stress, Apoptose und DNA-Schäden in ALI-kultivierten 16HBE14o-Zellen. Eine Herunterregulierung der CFTR könnte ein neuer mechanistischer Zusammenhang mit den oben genannten Effekten nach CNP-Exposition sein. Diese auf Umweltfaktoren zurückzuführenden Effekte könnten die Entwicklung unterschiedlicher Schweregrade des Phänotyps bei Patienten mit derselben CFTR-Mutation erklären.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind verfügbar unter https://iufduesseldorf-my.sharepoint.com/:f:/g/personal/thach_nguyen_iuf-duesseldorf_de/EgVUZhXYif9KpwqNXWab_ZoBAEaKUDr_FI2g0OsaAa0Jdw?e=BTXlR8 oder im Express Array-Repository (Zugang Nummer E-MTAB-11389).

Transmembran-Leitfähigkeitsregulator für zystische Fibrose

Kohlenstoffnanopartikel

Menschliche Bronchialepithelzelllinie

Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche

Feinstaub

Tricellulin

Transepithelialer elektrischer Widerstand

Fluoresceinisothiocyanat

Occludin

Elektronenmikroskopie

Oxford-Nanopore

Überflutet

CDH1

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Wir danken der University of California (Dr. Dieter Gruenert) für die freundliche Bereitstellung der 16HBE14o−-Zellen. Wir danken insbesondere Haribaskar Ramachandran für die fachkundige technische Unterstützung während der Überarbeitung, Diskussion und Kommentare zum Manuskript. Wir danken Jochen Dobner für die Diskussion und Kommentare zum Manuskript. Wir danken Christoph Schlager für die freundliche Bereitstellung der mathematischen Grundlagen zur Berechnung der ungefähren Partikelmasse. Wir danken Roeland Dijkema und Eva Rennen (VSParticle) sowie Bastian Gutmann und Christoph Schlager (Vitrocell) für ihre Unterstützung beim Versuchsaufbau und Dr. Christof Asbach (IUTA) für seine fachkundige Beratung und Ratschläge zum Versuchsaufbau und zur Partikelcharakterisierung.

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IUF – Leibniz-Forschungsinstitut für Umweltmedizin, Auf'm Hennekamp 50, 40225, Düsseldorf, Deutschland

Torben Stermann, Thach Nguyen, Selina Woeste, Inken Hacheney, Jean Krutmann, Klaus Unfried, Roel PF Schins & Andrea Rossi

IUTA – Institut für Energie- und Umwelttechnik e.V., Duisburg, Germany

Burkhard Stahlmecke & Ana Maria Todea

Medizinische Fakultät, Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf, Deutschland

Jean Krutman

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Konzipierte und gestaltete die Studie: TS, JK, KU, RPFS, AR Durchgeführte Forschung: TS, BS, AMT, SW, IH Analysierte Daten: TS, TN Verfasste das Manuskript: TS, AR Bearbeitete das Manuskript: BS, AMT, RPFS, KU-Betreuung: AR Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Andrea Rossi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Stermann, T., Nguyen, T., Stahlmecke, B. et al. Kohlenstoffnanopartikel beeinträchtigen die CFTR-Expression und toxikologisch relevante Signalwege. Sci Rep 12, 14255 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18098-8

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Eingegangen: 21. Januar 2022

Angenommen: 05. August 2022

Veröffentlicht: 22. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18098-8

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Kohlenstoffnanopartikel beeinträchtigen die CFTR-Expression und toxikologisch relevante Signalwege